[發明專利]一種暹羅鱷血粉增強小鼠免疫功能的方法

在審

• 申請號: 201711079198.7
• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN109758479A
• 公開（公告）日: 2019-05-17
• 發明（設計）人: 昝秀芳
• 申請（專利權）人: 昝秀芳
• 主分類號: A61K35/58
• 分類號: A61K35/58;A61P37/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一種暹羅鱷血粉增強小鼠免疫功能的方法，采用6.4、1.6、0.4mg/kg bw劑量的鱷魚血粉給小鼠經口灌胃30d，進行小鼠脾淋巴細胞增殖反應實驗、單核巨噬細胞吞噬實驗、NK細胞殺傷細胞實驗。

技術領域

本發明涉及一種暹羅鱷血粉增強小鼠免疫功能的方法，具體地說是以一種暹羅鱷血粉增強小鼠免疫功能的方法。

背景技術

目前公知的隨著鱷魚人工養殖的成功，其價值得到多方面的開發，包括旅游觀賞、餐飲加工、時裝皮具等。自1999年Sharbanay報道海水鱷血清有抗菌活性以來，國外、國內許多學者對鱷魚血的功效進行了研究，發現鱷魚血具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤等方面的作用，鱷魚血的這些功能是否是通過調節免疫來實現的呢，關于鱷魚血的免疫增強作用尚未見報道。

發明內容

材料與方法 1、材料與試劑；鱷魚血采自人工養殖暹羅鱷(Crocodylussiamensis)，來源于海南三亞龍虎園養殖場，本試驗室制備。清潔級 BALB/C 小鼠，雄性，60只，18～22g。刀豆蛋白 A(ConA)、染液、Hanks 液(pH7.2～7.4) RPMI1640 完全培養液、乳酸鋰、碘硝基氯化四氮唑 (INT)、吩嗪二甲酯硫酸鹽(PMS)、NAD、Tris-HCl 緩沖液(pH8.2)、1%NP40、臺盼蘭、1mol/L 鹽酸等。2、儀器與設備；5mm直徑打孔器、顯微鏡、微量血凝試驗板、離心機、酶標儀、96 孔培養板、5%CO2 培養箱、200 目篩網、注射用墨汁、721 型分光光度計。3、動物實驗分組與劑量設定；實驗動物用于2項實驗，分別為碳廓清實驗和臟器/體重實驗、小鼠脾淋巴細胞轉化實驗。每項50只動物，分為5個組，每組10只動物，分別為對照組、4倍人體攝入量組、1倍人體攝入量組、0.25倍人體攝入量組和豬血對照組。1倍人體攝入量為400mg/天。灌胃體積為0.2ml/20gbw。4、指標測定 ConA 誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化實驗；小鼠連續灌胃30d后，頸椎脫臼處死，無菌取脾，置于盛有適量無菌Hanks液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾撕碎，經200目篩網過濾，制成單細胞懸液，將細胞懸液分為兩部分，用于ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞轉化實驗。用Hanks液洗滌細胞懸液2次，每次離心10min(1000r/min)，然后將細胞懸浮于1ml的完全培養液中，臺盼蘭染色計數活細胞數(在95%以上)，調整細胞濃度為3×106個/ml。將每份細胞懸液分兩孔加入24孔培養板中，每孔1ml，一孔加75μlConA液作為實驗，另一孔作為對照，置培養箱中培養72h。培養結束前4h，每孔吸去上清液0.7ml，加入0.7ml不含血清的RPMI1640培養液，同時加入 MTT 50μl/ 孔，繼續培養4h。培養結束后，每孔加入1ml酸性異丙醇，吹打混勻，使紫色結晶完全溶解。然后分裝到96孔培養板，每孔做3個平行孔，用酶標儀以570nm波長測定光密度值。以實驗孔與對照孔OD的差值代表淋巴細胞增殖能力。小鼠NK細胞活性測定(乳酸脫氫酶LDH測定法)；實驗前24h按常規培養靶細胞、效應細胞，取靶細胞和效應細胞各100μl(效靶比50:1)，加入96孔培養板中；靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養液各100μl、靶細胞最大釋放孔加靶細胞和1%NP40各100μl，上述各項均設三個復孔，于37℃、5%CO2培養箱中培養4h，然后將培養板1500r/min離心5min，每孔吸取上清液100μl置96孔培養板中，同時加入LDH基質液100μl，反應3min，每孔加入1mol/L的HCl30μl，在酶標儀490nm處測定光密度值(OD)。小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗(半體內法)；小鼠連續灌胃30d后，每鼠腹腔注射2% 雞紅細胞懸液 1ml。30min后，頸椎脫臼處死動物，仰位固定于蠟板上，正中剪開腹壁皮膚，經腹腔注入生理鹽水2ml，轉動鼠板1min，然后吸出腹腔洗液1ml，平均分滴于2片載玻片上，放入墊有濕紗布的搪瓷盒內，于37℃孵箱溫育30min。孵畢，在生理鹽水中漂洗，除去未貼片細胞。晾干，以1:1(V/V)丙酮甲醇溶液固定20min，4%(V/V)Giemsa-磷酸緩沖液染色3min，再用蒸餾水漂洗晾干，于顯微鏡下計數巨噬細胞。統計學方法；測定結果數據均用x±s表示，用SPSSl6.0軟件對結果進行t檢驗統計學處理，P＜0.05為差異有顯著性意義。對于NK細胞殺傷活性的實驗。