[發(fā)明專利]一種殼聚糖分子信標納米復合物的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711075933.7
• 申請日: 2017-11-06
• 公開（公告）號: CN108939083A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發(fā)明（設計）人: 朱海振;郭熠;朱海燕;候凈;劉鑫;胡建軍;江飛龍;李杭;譚詩生;楊飛月;俞婕;崔媛媛
• 申請（專利權(quán)）人: 貴州省人民醫(yī)院
• 主分類號: A61K47/36
• 分類號: A61K47/36;A61K49/00
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發(fā)明一種殼聚糖分子信標納米復合物的制備方法，通過用自組裝法合成殼聚糖miR?155(microRNA?155)分子信標納米復合物，該殼聚糖miR?155(microRNA?155)分子信標納米復合物能夠根據(jù)熒光強度動態(tài)監(jiān)測肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程，同時通過與腫瘤細胞高表達的miR?155結(jié)合進一步抑制miR?155的表達，從而達到抑制腫瘤的目的，可應用于肺癌細胞及肺癌荷瘤鼠活體動物成像及腫瘤治療，具有轉(zhuǎn)染效率高、特異性高、穩(wěn)定性好、背景低、抑瘤率高等特點，將為肺癌的早期診斷及治療提供新思路、新方法和新技術(shù)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種殼聚糖分子信標納米復合物的制備方法。

背景技術(shù)

肺癌是嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率逐年攀升，早期診斷及早治療是改善患者預后的關(guān)鍵，但是肺癌患者在病變早期往往無明顯癥狀，就診時大多為中晚期，喪失了治療的最佳時機。因此從肺癌發(fā)生的“起源”著手，探尋高效、特異的早期診斷及治療的新方法，將會對肺癌的預防、診斷及治療產(chǎn)生深遠的影響。

腫瘤干細胞理論認為在腫瘤組織細胞中存在一群數(shù)量極少的腫瘤細胞，稱為腫瘤干細胞，所有的腫瘤細胞都是由腫瘤干細胞分化來的。微小RNA (miRNA，microRNA)在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，檢測NSCLC干細胞相關(guān)的miRNAs是肺癌早期診斷的一個重要策略。研究表明常見的不同腫瘤類型呈現(xiàn)特征性的miRNAs表達譜，這將為腫瘤的組織來源、診斷和治療提供依據(jù)，特征性的miRNA表達譜可以作為腫瘤早期診斷和治療分子標志物，也可判斷不同腫瘤的預后、預測治療效果。多項研究顯示miR-155在NSCLC中高表達，檢測肺組織內(nèi)的miR-155表達水平能區(qū)分肺癌患者與非肺癌患者，而且檢測腫瘤組織內(nèi)的miR-155表達水平能預測患者的腫瘤復發(fā)和不良預后風險。肺癌干細胞中miR-155表達高于普通肺癌細胞，如果能夠直接攜帶熒光物質(zhì)或化療藥物靶定肺癌細胞甚至肺癌干細胞，將有望最終達到早期診斷和根治肺癌的目的。分子信標(molecular beacon，MB)是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)原理設計的一種高靈敏性和高特異性檢測工具，實際上是一種呈莖環(huán)結(jié)構(gòu)的雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對。未結(jié)合目標鏈時，位于其末端的熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，熒光被淬滅；當分子信標與目標鏈結(jié)合時，分子信標的空間構(gòu)象發(fā)生改變，熒光基團遠離猝滅基團，熒光信號恢復，并且結(jié)合后不會輕易分離，因此分子信標是一種特異性檢測DNA、RNA和miRNA的靶向序列的發(fā)夾型核酸探針，可被用來進行核酸-核酸和活細胞內(nèi)可視化研究。

常規(guī)分子信標本身易被核酸酶或核結(jié)合蛋白降解，存在穩(wěn)定性差、細胞攝取困難等缺點。而用鎖核酸(1ocked nucleic acid，LNA)修飾堿基，由于幾何和立體性質(zhì)改變，其在較高溫度的環(huán)境中能穩(wěn)定存在，抗核酸酶降解的能力顯著增強，具有與DNA/RNA強大的雜交親和力，且結(jié)合后不會輕易分離。利用分子信標的關(guān)鍵是如何獲得理想的轉(zhuǎn)運載體，既可有效地保護免于被降解，又可高效地將分子信標遞送入宿主細胞發(fā)揮靶向識別并結(jié)合抑制核酸序列的功能。殼聚糖(chitosan，CS)納米為天然陽離子多糖，體外及體內(nèi)實驗均證實了殼聚糖作為轉(zhuǎn)移載體的安全性及有效性，其主要特點有：①組織相容性好、免疫原性低，毒性?。虎诤烧姡着cDNA分子自組裝結(jié)合成納米復合物，形成穩(wěn)定的核殼結(jié)構(gòu)，且對DNA有保護作用；③制作過程簡單、溫和，對DNA、抗體等生物大分子理化性質(zhì)影響??；④殼聚糖納米表面密集的活性氨基基團便于大分子修飾和耦聯(lián)。

在現(xiàn)有技術(shù)中，已有研究表示殼聚糖可攜帶化學藥物遞送到腫瘤部位；也有報道殼聚糖納米攜帶質(zhì)粒等基因用于腫瘤的治療，但同時用于腫瘤基因診斷和治療的報道較少。現(xiàn)有技術(shù)中的分子信標或者殼聚糖納米等復合物制備方法復雜，工藝條件苛刻，且這些復合物只能用于診斷肺癌的中、晚期，這會使肺癌患者錯過最佳治療時間，影響肺癌患者的治療，同時這些復合物在用于診斷肺癌的特異性或穩(wěn)定性等方面中至少有一方面效果不佳，因此急需一種制備方法簡便且可獲得特異性高、穩(wěn)定性好的新思路、新方法的診斷和治療肺癌的試劑，尤其是早期可以診斷和治療的肺癌優(yōu)良試劑。