[發明專利]一種CAR?Treg細胞的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201711066339.1
• 申請日: 2017-11-02
• 公開（公告）號: CN107557342A
• 公開（公告）日: 2018-01-09
• 發明（設計）人: 李相魯;張嚴冬;李俊;謝海濤;李莉
• 申請（專利權）人: 廣東萬海細胞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/867;A61K35/17;A61P37/00
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務所(普通合伙)11548
• 代理人: 李靜

技術領域

本發明涉及免疫學和分子生物學領域，具體而言，涉及一種制備CAR-Treg細胞的方法以及制得的CAR-T 細胞及其應用。

背景技術

自身免疫性疾病(autoimlnune disease)是指以自身免疫應答反應導致組織器官損傷和相應功能障礙為主要發病機制的一類疾病。是臨床上常見的一大類疾病，目前已被公認的自身免疫性疾病至少有30 多種。根據自身免疫反應對組織器官造成損傷的范圍，通常將自身免疫性疾病分器官特異與非器官特性兩大類。

臨床上常見的自身免疫性疾病包括：結締組織疾病：類風濕關節炎(RA)、幼年特發 性關節炎(JIA)、系統性紅斑狼瘡(SLE)、干燥綜合征(SS)、多肌炎/皮肌炎(PM/DM)、硬皮病(SSc)、系統性血管炎；神經肌肉疾病：多發性硬化癥(MS)、重癥肌無力(MG)、脫髓鞘疾病；內分泌性疾病：原發性賢上腺皮質萎縮、慢性甲狀腺炎、糖尿病；消化系統疾病：炎性腸病(克羅恩病、潰瘍性結腸炎)、慢性活動性肝炎、惡性貧血與萎縮性胃炎；泌尿系統疾病：自身免疫性腎小球腎炎、肺腎出血性綜合征；血液系統疾病：自身免疫性溶血性貧血、原發性血小板減少性紫癜(ITP)、特發性白細胞減少癥。

B 淋巴細胞或稱B 細胞來源于骨髓的多能干細胞，由骨髓中的造血干細胞分化發育而來。與T 淋巴細胞相比，它的體積略大。這種淋巴細胞受抗原刺激后，會增殖分化出大量漿細胞。漿細胞可合成和分泌抗體并在血液中循環。

從骨髓來的干細胞或前B 細胞，在遷入法氏囊或類囊器官后，逐步分化為有免疫潛能的B 細胞。成熟的B 細胞經外周血遷出，進入脾臟、淋巴結，主要分布于脾小結、脾索及淋巴小結、淋巴索及消化道粘膜下的淋巴小結中，受抗原刺激后，分化增殖為漿細胞，合成抗體，發揮體液免疫的功能。目前使用的大多數疫苗就是通過刺激這類B 淋巴細胞產生抗體的。B 細胞在骨髓和集合淋巴結中的數量較T 細胞多，在血液和淋巴結中的數量比T 細胞少，在胸導管中則更少，僅少數參加再循環。B 細胞的細胞膜上有許多不同的標志，主要是表面抗原及表面受體。這些表面標志都是結合在細胞膜上的巨蛋白分子。

B 淋巴細胞的祖細胞存在于胎肝（胚胎小鼠14 天或通順兒8-9 周）的造血細胞島（islanksofhaemopoieticcells）中，此后B 淋巴細胞的產生和分化場所逐漸被骨髓所代替。B 淋巴細胞（blymphocytes）簡稱B 細胞，成熟的B 細胞主要定居于淋巴結皮質淺層的淋巴小結和脾臟的紅髓和白髓的淋巴小結內。B 細胞在抗原刺激下可分化為漿細胞，合成和分泌免疫球蛋白，主要執行機體的體液免疫（humoralimmunity）。

B 細胞在自身免疫病中起著重要作用，在皮膚科方面，系統性紅斑狼瘡患者的B 細胞反應性過高，產生多種自身抗體，抗核抗體在SLE 發病機制中起關鍵作用，可形成免疫復合物導致損傷。B 細胞還可激活致病性T 細胞。SLE病人中B 細胞活化因子升高并與疾病活動性和抗dsDNA 抗體水平升高相關。

干燥綜合癥（SS）的B 細胞產生多種自身抗體，有的已證明與疾病的系統受累相關。SS 的血清BAFF 水平也升高并與病人自身抗體的水平相關。尋常性天皰瘡（PV）和落葉狀天皰瘡（PF）由抗橋粒芯糖蛋白（Dsg）自身抗體Dsg1和Dsg3 單獨或共同引起。皮肌炎（DM）存在補體系統的活化，導致膜攻擊復合物沉積于病人的毛細血管。病人肌肉炎癥浸潤中血管周圍的B 細胞數比肌內膜的T 細胞多。活動性DM 病人外周血B 細胞和Th 均活化，后者Th2 占優勢。DM 病人血清BAFF 水平顯著升高。

調節性T 細胞其具有免疫應答低下和免疫抑止兩大特征，通過“主動”的方式抑止免疫系統――發揮免疫負調作用。現已證實，除CD4Treg 外，部分CD8 T 細胞也為Treg。根據來源及作用機制，Treg 可分為天然產生的CD4+CD25+Treg(自然調節性T 細胞，nTreg)和誘導的適應性調節T 細胞(aTreg或iTreg)，如Th3、Trl 細胞等(CD4+CD25+Treg：CD4+CD25+Treg)除表達CD4分子和CD25 分子外，其特征性標志為Foxp3+。Foxp3 又稱叉頭狀／翅膀狀螺旋轉錄因子，在調控調節性T 細胞的發育中起重要作用，且對其發育和功能是必要的。CD4+CD25+Treg 可抑止免疫系統及相關免疫細胞的功能和活性，從而發揮免疫負調節作用。同時，TGF-p 也可誘導CD4+CD25+Treg 的增生。研究表明，CD4-CD25+Treg 能以細胞因子依賴(1L-10 和TGF-和非細胞因子依賴)兩種機制發揮免疫負調作用。