[發明專利]一種黑色素瘤抗原A3殺傷人肝癌細胞的方法

在審

• 申請號: 201711065401.5
• 申請日: 2017-11-02
• 公開（公告）號: CN109749994A
• 公開（公告）日: 2019-05-14
• 發明（設計）人: 王燕俠
• 申請（專利權）人: 王燕俠
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

一種黑色素瘤抗原A3殺傷人肝癌細胞的方法，采用粒—巨噬細胞集落刺激因子（GMCSF）和白介素4（interleukin4，IL4）從人外周血中誘導樹突狀細胞，經MAGEA3抗原致敏后與T淋巴細胞共培養，以淋巴細胞為效應細胞，分別以表達MAGEA3抗原的肝癌細胞株H4M、不表達MAGEA3抗原的正常肝細胞為靶細胞，收集T淋巴細胞進行腫瘤細胞殺傷試驗。

技術領域

本發明涉及一種黑色素瘤抗原A3殺傷人肝癌細胞的方法，具體地說是以一種黑色素瘤抗原A3殺傷人肝癌細胞的方法。

背景技術

目前公知的人黑色素瘤抗原A3（melanomaantigengene，MAGEA3）在多種腫瘤組織中表達，而且在肝細胞肝癌（hepatocellularcarcinoma，HCC）中也有較高頻率的表達，但在正常組織中除胎盤和睪丸外均不表達，因此在抗腫瘤免疫治療中是理想的靶抗原。樹突狀細胞（dendriticcells，DCs）是體內唯一能激活初始型T細胞的專職抗原提呈細胞，DCs在誘導機體產生特異性抗腫瘤免疫反應中具有特別重要的作用。

發明內容

材料與方法；質粒與細胞株含MAGEA3cDNA的重組質粒pGEX4T1MAGEA3為本室自行構建。肝癌細胞株H4M及正常肝細胞株L02由中山大學第一附屬醫院病理科原代培養建株。主要試劑RPMI1640培養基購自Gibcobrl公司；胎牛血清購自Hyclone公司；異硫氰酸熒光素（FITC）標記的小鼠抗人CD80、CD86單克隆抗體及藻紅蛋白（PE）標記的小鼠抗人CD83、人類白細胞抗原DR單克隆抗體均購自Pharmingen公司；兔抗人MAGEA3多克隆抗體購自NeoMarkers公司。MAGEA3蛋白的分離與純化重組質粒pGEX4T1MAGEA3轉化大腸桿菌BL21，經異丙基硫化βD半乳糖苷（IPTG）誘導表達。取1000mL誘導表達的菌液，10000g、4℃離心5min；菌體沉淀用50mL磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline，PBS）重懸，冰浴，超聲裂解細菌，加入TritonX100至終體積分數為1%，混勻，冰浴放置30min；12000g、4℃離心20min；取上清液，采用十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳用5 mL谷胱苷肽硫轉移酶（glutathinStransferase，GST）層析柱分離融合蛋白，經SDSPAGE及凝膠薄層掃描鑒定純化蛋白的純度；PBS透析24h，過濾除菌，-70℃保存。DCs的體外培養及抗原致敏采用Ficoll常規分離5名正常獻血員外周血獲得單個核細胞，調整其細胞密度為2×106／mL，加1mL于24孔板中，在37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中培養3h后，吸去懸浮細胞，加入DCs培養基（含rhGMCSF100ng/mL、rhIL450ng/mL的RPMI1640），在37℃、體積分數為5%的CO2條件下培養，每3d換液1次。通過倒置顯微鏡觀察DCs樹突狀外形，同時采用流式細胞儀檢測DCs表面HLADR、CD80、CD83、CD86的表達。收集第7天的DCs，調整細胞濃度為3×106個/mL，接種于24孔板中，分別加入GSTMAGEA3蛋白（20μg/mL）50、100、200、300μL，GST蛋白（20μg/mL）100μL和PBS100μL培養24h；加入TNFα(50U/mL)，繼續培養2d。細胞株的培養分別傳代培養正常肝細胞株L02和肝癌細胞株H4M；將細胞懸液（濃度為1×105個/mL）制成爬片，免疫組化染色檢測MAGEA3蛋白的表達。T淋巴細胞的制備及CTL的體外誘導取同1個體外周血，Ficoll常規分離單個核細胞，用培養液調整其細胞密度為1×106/mL；按照淋巴細胞與DCs細胞數量比為5∶1的比例混合培養后，分以下幾組：A組為未與DCs混合培養的淋巴細胞（空白對照組）；B組為淋巴細胞+DCs（未負載融合蛋白，以PBS替代）；C組為淋巴細胞+DCs（負載20μg/mL融合蛋白50μL）；D組為淋巴細胞+DCs（負載20μg/mL融合蛋白100μL）；E組為淋巴細胞+DCs（負載20μg/mL融合蛋白200μL）；F組為淋巴細胞+DCs（負載20μg/mL融合蛋白300μL）；G組為淋巴細胞+DCs（負載20μg/mLGST蛋白100μL）。每3d半量換液，補充PHA和rhIL2，以促進DCs的成熟，增強DCs的抗原提呈能力；于37℃、體積分數為5%CO2、飽和濕度培養箱中培養7d，實驗終止前4h，每孔加入新鮮配制的5mg/mL的MTT20μL，倒置顯微鏡下觀察；1000r/min離心5min，去上清液，每孔加入DMSO150μL，振蕩5min，于酶標儀上570nm處讀取吸光度(D)值，按下列公式計算刺激指數：Is=D實驗組/D空白對照組。然后，調整淋巴細胞與DCs細胞數量比分別為10∶1、20∶1、50∶1、100∶1，同樣按照上述A至G的分組重復以上實驗步驟，以比較不同組淋巴細胞的增殖能力，每組計數3次，取平均值。以未與DCs混合培養的淋巴細胞作為空白對照。CTL的殺傷效應以培養第7天的淋巴細胞為效應細胞，以MAGEA3陽性的H4M肝癌細胞為靶細胞，按效靶比（細胞數量比）為10∶1，在以下各組中同時加入淋巴細胞和靶細胞進行殺傷實驗，其中靶細胞為2×104個/孔，效應細胞做相應調整；每組另設3個復孔，以PBS為空白對照，于37℃、體積分數為5%CO2培養箱孵育48h。分組如下：Ⅰ組為肝癌細胞+經負載GSTMAGEA3融合蛋白的DCs刺激的淋巴細胞；Ⅱ組為肝癌細胞+經負載GST蛋白的DCs刺激的淋巴細胞；Ⅲ組為肝癌細胞+未負載GSTMAGEA3融合蛋白的DCs刺激的淋巴細胞；Ⅳ組為肝癌細胞+未經DCs刺激的淋巴細胞；Ⅴ組為淋巴細胞（效應細胞）；Ⅵ組為肝癌細胞（靶細胞）；以MAGEA3陰性的正常肝細胞L02為靶細胞，重復上述實驗分組。然后，調整效靶比分別為20∶1、50∶1、100∶1，同樣按照上述Ⅰ至Ⅵ的分組重復以上實驗步驟，以比較不同效靶比情況下的CTL的殺傷效應。MTT法檢測淋巴細胞的殺傷活性在結束培養前4h吸棄上清，加入新鮮配置的MTT（5mg/mL）20μL/孔，置于37℃、體積分數為5%CO2培養箱孵育4h；棄上清，加入DMSO150μL/孔，室溫下振蕩至結晶物溶解；在酶標檢測儀上，用空白對照孔調零后測各孔D570值，對于D＜0者按照0值計算，計算殺傷率：p殺傷/%＝［Ｄ靶細胞-(D效靶細胞-D效應細胞)］/D靶細胞×100%。統計學處理使用統計軟件SPSS100完成。