[發明專利]改進空隙及孔隙促進細胞黏附率的復合支架及制備方法

在審

• 申請號: 201711060223.7
• 申請日: 2017-11-01
• 公開（公告）號: CN107854732A
• 公開（公告）日: 2018-03-30
• 發明（設計）人: 曲志偉;肖霄;李保強;閆景龍;畢佳琦
• 申請（專利權）人: 哈爾濱市第一醫院
• 主分類號: A61L27/56
• 分類號: A61L27/56;A61L27/20;A61L27/12;A61L27/22;A61L27/50
• 代理公司: 北京國坤專利代理事務所(普通合伙)11491
• 代理人: 黃耀鈞

技術領域

本發明屬于復合支架技術領域，尤其涉及一種改進空隙及孔隙促進細胞黏附率的復合支架及制備方法。

背景技術

骨缺損是骨科臨床上常見的問題，每年全世界多達有220萬人因外傷、感染、腫瘤等原因而需要骨移植治療，而在美國，每年需植骨的病人中大約60％采用自體骨移植，34％采用異體骨移植，僅7％的病人采用其它植骨材料。對于外傷，骨腫瘤等各種骨病所引起的骨不連和骨缺損，通常是應用自體或者是同種異體的骨移植來治療。這些方法雖然也很有效，但仍經常遇到材料來源不足，供體疾病的傳染風險，移植材料的塑性困難等。人工植入物由人工合成制備，可以不受供源限制，又由于它是惰性物質，所以避免免疫排斥，然而人工植入物在功能上無法完全替代生物組織與器官，而且有時也會產生異物反應。因此，至今臨床上還沒有一個完美的方法可以完全解決受損組織和器官的修復問題。因此一定程度上促成了組織工程療法的快速發展。組織工程化器官將比供體器官更易于獲得，由組織工程再造的組織和器官不但可以同人工替代物一樣進行大批量的生產，而且這樣的組織和器官同天然的組織和器官具有相同的功能，還可防止免疫排斥的產生，被認為是最有希望徹底解決組織和器官修復難題的途徑。自1995年來骨組織工程由Crane等提出后取得了長足的發展，作為組織工程研究的重要領域，骨組織工程研究在多個方面均取得了令人振奮的研究成果，并已在臨床得到初步應用，被認為是組織工程中最具有前途和可行性的領域之一。目前最有希望在臨床廣泛使用的骨組織工程種子細胞是骨髓基質干細胞。它具有來源方便，取材簡單，對患者的損傷小等優勢。BMSCs具有自我更新的能力并且能夠多向分化，這是干細胞的共性。已有大量研究證實無論是在裸鼠等、鼠小動物，還是山羊等大動物的體內，BMSCs作為種子細胞都能夠有效的形成組織工程骨并成功修復各個部位的骨缺損而且有研究表明成人BMSCs在適宜的誘導條件下也能夠表現成骨細胞的形態和功能，并且在裸鼠體內形成組織工程骨，在目前使用BMSCs也取得了相應的良好的療效也常見諸報端。隨著近些年骨組織工程的快速發展，支架材料的選擇和制備成為了研究的熱點，理想的骨組織工程支架材料應滿足以下幾點：1、生物相容性高：除如無毒、不致畸等滿足生物材料的一般要求之外，還要有降解產物對細胞無毒害作用，不引起炎癥反應并且利于種子細胞的粘附、增殖，對于細胞的生長和分化有促進作用；2、生物降解性適合：支架材料應具有降解功能，骨組織細胞生長速率應與降解速率相適應；3、具有合適的三維立體多孔結構：支架材料應具有三維立體結構，相應的孔隙率，比表面積高，能夠為成骨性細胞的黏附、增殖、生長和功能的發揮提供一個最佳的微環境，同時也能夠為新骨組織的形成提供空間和支架；4、可塑性和適合的機械強度：支架材料具有良好的可塑性和適合的機械強度，能夠支撐新生組織，并直至新生組織具有適當力學特性；5、良好的支架-細胞界面：材料應提供良好的支架-細胞作用界面，利于細胞粘附。生物陶瓷是一種晶體材料，是由金屬離子及非金屬離子以離子鍵結合的。根據生物陶瓷在生理環境中的化學活性可分為四類：惰性生物陶瓷、表面活性生物陶瓷、可吸收生物陶瓷及復合生物陶瓷。硫酸鈣陶瓷、碳酸鈣陶瓷、磷酸鈣陶瓷及其同分異構體都屬于可降解生物陶瓷。硫酸鈣因無骨誘導作用，脆性大所以應用較少。Cheroff從珊瑚中提取碳酸鈣陶瓷并于犬的股骨、脛骨骨缺損模型修復中應用。目前廣泛應用的骨替代材料之一是以羥基磷灰石為代表的磷酸鈣鹽陶瓷，它們的骨傳導性能都非常好。因為羥基磷灰石的脆性較大且不易被吸收等這些缺點均限制了其在承重部位的應用。生物衍生骨是這樣的一類生物材料。它是用人或動物的骨組織經過一系列方法處理后，將其細胞成分和抗原性去掉，完全或部分保存原來組織網架結構。在國際上已有生物衍生骨材料的產品應用于臨床，如Oswestry骨、Bio-Oss、Kiel骨骨等，并且在臨床上取得了良好的療效。李彥林等應用豬的肋骨制備成部分脫鈣骨、完全脫蛋白骨、部分脫蛋白骨三種材料，而且測定了這三種的衍生骨性能。通過電鏡觀察表明，有原骨組織的網狀孔隙結構系統是這三種材料的共性，但它們又各具特點：完全脫蛋白骨(即煅燒骨)的抗原性是三種里最小的，有良好的成骨效果，能夠在臨床應用并且取得一定的療效，但機械強度差，有待改進；部分脫蛋白骨具有弱抗原性，其機械強度尚可，但成骨效果不理想；脫鈣骨抗原性是三種里最強的，影響成骨，基本無法單獨應用。廣泛存在于蝦、蟹、昆蟲等動物的甲殼中的甲殼質脫乙酰后即為殼聚糖，在天然有機化合物中，其數量在自然界僅次于纖維素。殼聚糖是一種新型天然醫用生物材料，無毒、有良好的生物相容性，并且其在體內分解后產物可直接代謝并對人體無害。殼聚糖能引導或促進骨的形成有一定的骨傳導性。殼聚糖是無抗原性能夠誘導細胞增殖并且可以促進植入體與宿主組織一體化。Klokkevold等研究了殼聚糖對體外成骨細胞分化和骨形成的影響，實驗結果表明，殼聚糖可以促進前期骨細胞分化，加速骨形成的作用。脫去乙酰基的鏈節數占所有鏈節數的百分比為殼聚糖脫乙酰度。殼聚糖脫乙酰度影響著殼聚糖的溶解性能，而且直接決定其分子鏈上氨基(NH2)含量的多少，因為當其脫乙酰度為50％時，殼聚糖可以獲得最佳的溶解性。根據脫乙酰度不同，殼聚糖的pH值在6.5-7.3之間，在殼聚糖中氨基被質子化后，殼聚糖溶液行為表現為弱的聚陽離子電解質。殼聚糖上的氨基和羥基是具有反應活性的基團，因此可以通過化學改性使之具有新功能，如在殼聚糖分子結構進行醋化以增加其溶解性。殼聚糖還有一種特性就是抑菌，它能夠抑制細菌的生長和降低其活性。然而必須指出的是不同殼聚糖的種類，以及分子量，并且濃度等一些條件對其抗菌的效果均有影響。殼聚糖無論何種生物材料其生物相容性是首先必須要評估的。Vandevord等采用異位成骨法來評定的，他首先將冷凍干燥CS溶液法制備出的多孔支架材料切成邊長為1.5cm正方體小塊消毒后在PBS中清洗，然后植入老鼠背部和腹部。分別在一定的時間點上觀察炎癥反應，組織學評價和細胞免疫學反應。最后發現支架材料在體內沒有發生炎癥反應；在HE染色中發現有嗜中性細胞聚集在支架材料周圍，但是當植入時間延長這些嗜中性細胞便逐漸消失，而且發現有膠原在支架孔中生成，說明在最初植入時支架材料有非常低的細胞免疫反應，或者是手術造成的應激反應。這些都說明CS支架具有較高的生物相容性，在生物相容性這點上可以作為支架材料和植入材料進行應用。有人用電紡絲方法制備了具有一定結構的CS支架，并在其上面種植了新西蘭白兔關節部位截取的軟骨細胞共同培養，最后發現支架可以很容易的與軟骨細胞形成緊密結合。殼聚糖在生物體內是如何降解的目前還有很多爭議，但較多的學者認為殼聚糖主要是依靠體內環境中的酶降解，如果在中性的水介質中CS的降解較慢。在體內殼聚糖可以很容易的被溶菌酶等酶類降解，其體內降解最終產物氨基葡萄糖，可以完全被人體吸收無毒。殼聚糖能夠對機體細胞產生影響是通過粘附、激活和促進及抑制等來作用的。殼聚糖的細胞粘附作用在文獻報道中出現較多，其中對成骨細胞和成纖細胞的粘附作用占主要部分。殼聚糖及其衍生物可以抑制微生物生長、止血、止痛、并且能夠促進或抑制成纖維細胞增殖、遷移、生長、激活和趨化巨噬細胞、誘導有序的膠原沉積和纖維排列、有利于新生組織的結構重塑和構建等活性，決定了其在組織工程中有重要應用。殼聚糖能夠對機體細胞產生影響是通過粘附、激活和促進及抑制等來作用的。殼聚糖的細胞粘附作用在文獻報道中出現較多，其中對成骨細胞和成纖細胞的粘附作用占主要部分。組織工程的發展對生物材料提出了新要求。研制出具有能產生所期望的宿主反應的能力的生物材料才是追求的目標，從材料表面所發生的蛋白質吸附、免疫反應、細胞因子和生長因子的釋放、目標細胞的反應著手，誘發期望的愈合途徑，使組織重建。高細胞親和性組織工程支架是今后生物材料的主要發展方向。