[發(fā)明專利]一種嘔吐毒素核酸適配體親和柱及其制備方法與應用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201711050103.9
• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號: CN107807034A
• 公開（公告）日: 2018-03-16
• 發(fā)明（設計）人: 欒云霞;劉洪美;陸安祥;付海龍;王紀華
• 申請（專利權）人: 北京農(nóng)業(yè)質量標準與檢測技術研究中心
• 主分類號: G01N1/34
• 分類號: G01N1/34;G01N1/40;G01N30/08;B01D15/38;C12N15/115
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權代理有限公司11002
• 代理人: 王文君,郭奧博

技術領域

本發(fā)明涉及農(nóng)產(chǎn)品及其制品中嘔吐毒素檢測的前處理領域，具體涉及以嘔吐毒素核酸適配體為識別材料，將選擇性高、穩(wěn)定性好、易于合成的核酸適配體應用于固相萃取技術，制備成用于樣品中嘔吐毒素富集提純凈化的親和柱。

背景技術

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)，又名嘔吐毒素，是鐮刀菌屬的禾谷鐮刀菌、黃色鐮刀菌、頭孢菌屬、漆班菌屬、木霉屬等菌株的代謝產(chǎn)物，主要污染小麥、玉米、大麥等，具有很強的毒性。2003年我國對小麥、玉米、稻谷中DON的污染情況調(diào)查顯示，小麥、玉米DON污染較稻谷嚴重。我國在2005年頒布的糧食和食品中DON的限量標準，2011年頒布的國家食品安全標準—《食品中真菌毒素限量》中規(guī)定小麥、玉米中DON的最高限量為1000μg/kg。

真菌毒素的檢測是一種痕量檢測,一般儀器的靈敏度難以達到要求,加上受污染基質復雜,必須對基質中真菌毒素進行富集和凈化才能用于檢測。樣品前處理是樣品分析的第一步,也是整個樣品分析過程中的關鍵步驟,直接影響分析的準確度和精密度。傳統(tǒng)樣品前處理技術普遍存在耗時、低效、有毒有機溶劑用量大、操作較繁瑣等問題,為了解決上述問題,國內(nèi)外眾多研究人員開發(fā)了一系列新型的樣品前處理技術。基于吸附萃取原理的固相萃取、磁分離、親和色譜及微流控分離等樣品前處理技術具有簡單、高效、綠色等特點,其核心在于所選用的吸附材料。目前,凈化方法主要有液液萃取和色譜柱凈化等,但液液萃取法需大量有機溶劑,易造成環(huán)境污染和痕量毒素的回收率不高；色譜柱凈化法由于具有消耗試劑少,操作簡單成為毒素凈化的主要方法。近年來，具有選擇性高、穩(wěn)定性好、制備簡單等特點的分子印跡聚合物成為固相吸附材料的研究熱點。但分子印跡材料的合成過程中不可避免地產(chǎn)生非特異性結合位點,且在生物樣品(常以水溶液形式存在)分析中的應用受到較大限制。因此,水溶液樣品適用性好、選擇性更強的生物識別體系對于復雜生物樣品中痕量、超痕量組分分析是較好的選擇。免疫親合柱(Immunoaffinitycolumn,IAC)凈化是柱色譜中應用較多的一種,但該方法是一種基于抗原/抗體間相互作用的凈化方法,易受樣品基質、pH值、溶劑、鹽濃度等的影響；IAC的價格比較昂貴,使得檢測成本較高；且已有報道用于制備免疫親和柱的抗體對真菌毒素及其代謝產(chǎn)物存在交叉反應,從而限制了該方法在毒素檢測中的應用。高親和力、高特異性的適配子作為一種結構穩(wěn)定、易于合成和修飾、可反復使用的新型抗體替代材料,將其應用于真菌毒素的前處理,可有效避免使用大量有機試劑,排除其它物質干擾,可多次反復使用,成本較IAC低很多。

核酸適配體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術經(jīng)體外篩選得到的可以特異性地識別目標物的一段短的單鏈寡核苷酸序列。與抗體相比,適配體具有性質穩(wěn)定、易化學合成、易化學修飾、分子量小和目標分子廣泛等優(yōu)點,目前在生物傳感器、毛細管電泳、物質分離富集以及醫(yī)療診斷等領域得到了廣泛應用選擇性高、穩(wěn)定性好、易于合成的核酸適配體在固相萃取技術中具有廣闊的應用前景。適配體對目標毒素具有很高的親和力,可顯著提高萃取選擇性,增強富集效率。因此,核酸適配體固相萃取技術在食品分析中具有很好的應用價值。近幾年，關于赭曲霉毒素OTA適配體親和柱的產(chǎn)品和應用較多，但對于嘔吐毒素還未見相關研究報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種嘔吐毒素核酸適配體。

本發(fā)明提供的3’端氨基修飾的嘔吐毒素核酸適配體具體為：5’-GCCCGGATCGAGTTGATTTCAAGCGCATGAAGGCTA-CCCCCCC-NH₂-3’。本發(fā)明通過大量研究獲得嘔吐毒素特異性核酸適配體，并在此基礎上通過對3’端進行氨基修飾，將該適配體應用到親和柱中，可以大幅度提高樣品的回收率，避免樣品損失。

本發(fā)明同時提供一種嘔吐毒素核酸適配體親和柱，其包括柱管以及填充在所述柱管底部的CNBr活化瓊脂糖凝膠；上述3’端氨基修飾的嘔吐毒素核酸適配體偶聯(lián)于所述CNBr活化瓊脂糖凝膠的表面。其結構可參考圖1所示。3’端和5’端不同修飾方式的適配體親和柱的回收率比較可參考圖2所示。

為了實現(xiàn)良好的嘔吐毒素富集效果，本發(fā)明對CNBr活化瓊脂糖凝膠與3’端氨基修飾的嘔吐毒素核酸適配體的最佳配比進行了優(yōu)化，具體而言，當二者質量比為1000:0.1～2、優(yōu)選為1000:1時，能夠在確保嘔吐毒素被充分富集的基礎上提高樣品的回收率。

為了使樣品在親和柱中洗脫時嘔吐毒素被充分富集，本發(fā)明優(yōu)選所述瓊脂糖凝膠的填充體積與所述柱管體積之比為(0.4～0.6)：1。