[發明專利]一種用于診斷牛結核病的流式細胞術檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201711049587.5
• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號: CN107831316A
• 公開（公告）日: 2018-03-23
• 發明（設計）人: 焦新安;陳祥;夏愛鴻;徐正中;李昕;朱兆成;胡婷;沈也馳;金珊珊;孟闖;潘志明;殷月蘭;孫林
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/577
• 代理公司: 北京華夏正合知識產權代理事務所(普通合伙)11017
• 代理人: 韓登營,陳辰

技術領域

本發明涉及一種檢測試劑盒，特別是涉及一種用于診斷牛結核病的流式細胞術(FCM)檢測試劑盒及其在牛結核病診斷領域的應用。

背景技術

牛結核病是一種主要由牛分枝桿菌引起的慢性消耗性人獸共患傳染病，我國將其列為二類動物疫病，被世界動物衛生組織(OIE)列為需通報的動物疫病。該病一年四季均可發生，呈世界性流行。牛分枝桿菌不僅導致了牛自身生產力的下降，更重要的是對人類健康構成了嚴重的威脅。因此，無論從畜牧業還是從公共衛生角度，加大對牛結核病的研究都有著迫切的需求和深遠的意義。而建立快速、特異性強、敏感度高的檢測方法是牛結核病檢疫中的關鍵步驟，也是臨床中亟待解決的問題。

白細胞介素2(Interleukin-2，IL-2)主要是由T淋巴細胞分泌的一種淋巴因子，在T細胞增殖、B細胞發育、NK細胞的活化等方面起重要作用，是一種能影響機體免疫反應各個方面的調節因子。牛感染牛分枝桿菌后，主要誘導機體產生Th1型細胞免疫應答反應，IL-2作為Th1型細胞免疫應答產生的主要細胞因子之一，其分泌水平反映著機體感染牛分枝桿菌的不同狀態。通過對牛白細胞介素2(boIL-2)的分泌水平進行檢測，這將在牛感染性疾病的診斷和免疫狀態的評價中發揮著重要的作用。

目前應用于臨床診斷牛結核病的主要方法為牛結核菌素皮內變態反應試驗和體外γ-干擾素釋放試驗。而兩種方法中使用的結核菌素純蛋白衍生物(PPD)成分復雜，包含的很多蛋白同時存在于致病分枝桿菌和非致病分枝桿菌中，不能區分結核陽性感染、免疫個體以及環境分枝桿菌感染等情況，從而限制了檢測方法的特異性和敏感性。此外，ELISA檢測方法是群體水平的檢測。如果群體細胞因子水平提高，既有可能是分泌細胞因子的細胞數量增加，也有可能是分泌細胞的數量沒增加而單個分泌水平增加，易造成假陽性。

因此，需要建立特異性更好的試劑盒用于牛結核病的檢測。

發明內容

為解決現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種針對牛結核病的FCM檢測試劑盒，該試劑盒能夠對牛結核病進行高特異性地檢測。

本發明的第一方面涉及一種用于診斷牛結核病的FCM檢測試劑盒，所述FCM檢測試劑盒包括：支持介質、熒光標記的CD4表面分子抗體、檢測抗體、特異性刺激劑，其中，所述檢測抗體能特異性結合并檢測牛細胞白介素2，特異性刺激劑為CFP-10和ESAT-6的融合蛋白。

本發明的第二方面涉及上述FCM檢測試劑盒在用于非診斷目的的牛分枝桿菌感染檢測中的應用，其中，所述非診斷目的包括流行病學分析和研究、離體組織進行檢測、表位鑒定研究以及定性和定量檢驗牛分枝桿菌抗原特異的boIL-2。

本發明的技術效果：

1)本發明試劑盒中所采用的由雜交瘤細胞株分泌的單克隆抗體具有效價高、特異性好、與天然抗原親和力強的優勢；

2)本發明試劑盒中所采用的牛分枝桿菌特異性抗原CFP-10、ESAT-6由RD1基因編碼，RD1只存在于結核分枝桿菌和牛型分枝桿菌，而在卡介苗BCG中缺失，因此CFP-10和ESAT-6作為刺激劑特異性更高；

3)本發明是基于牛分枝桿菌特異性抗原的FCM檢測試劑盒，相比于單純頸部皮內變態反應試驗和BOVIGAM^TM(Mycobacterium bovis Gamma Interferon Test Kit for Cattle)ELISA檢測試劑盒，能夠實現從單個細胞水平對特定亞型淋巴細胞分泌IL-2水平的檢測，排除了交叉反應和假陽性的干擾，顯示出良好的特異性；

4)該試劑盒還支持大批量樣品的快速檢測，同時相比較于其他細胞因子檢測試劑盒，該試劑盒僅需一種細胞因子抗體，節約了成本；

5)此外，該試劑盒的使用過程中可以將表面和胞內的染色同時進行，大幅縮減了試驗所需時間，簡化了操作步驟，降低了操作誤差，提高了靈敏度和分辨率。

附圖說明

圖1為實施例7中根據本發明的FCM檢測試劑盒的牛外周血單個核細胞(PBMC)樣品檢測結果圖：A.未刺激牛PBMC檢測結果；B.ConA刺激牛PBMC檢測結果；

圖2為實施例8中根據本發明的FCM檢測試劑盒的牛外周血單個核細胞(PBMC)樣品檢測結果圖：A.未刺激牛PBMC檢測結果；B.ConA刺激牛PBMC檢測結果；C.CFP-10和ESAT-6的融合蛋白刺激牛PBMC檢測結果。

具體實施方式

以下，對本發明的實施方式進行說明。