[發明專利]一種雙脫氧核苷封閉的寡核苷酸的制備方法及其應用

在審

• 申請號: 201711049299.X
• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號: CN109735607A
• 公開（公告）日: 2019-05-10
• 發明（設計）人: 張弛宇;張夢玲;胡軼紅
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海巴斯德研究所
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858
• 代理公司: 上海一平知識產權代理有限公司 31266
• 代理人: 王正君;肖艷

本發明提供一種雙脫氧核苷封閉的寡核苷酸的制備方法及其應用，具體地，本發明首次利用末端轉移酶(TdT)催化脫氧核苷酸(dNTPs)或雙脫氧核苷酸(ddNTPs)結合到DNA分子的3'羥基端的特性，將引物與四種雙脫氧核苷酸(ddATP，ddTTP，ddCTP或ddGTP)中的任何一種混合，TdT可以將雙脫氧核苷酸添加到引物的3’端，所獲得的這種被ddNTP修飾的引物不能被DNA聚合酶催化延伸。本發明所制備的雙脫氧封閉的寡核苷酸(引物)可以與等位基因PCR、校讀(proof?reading)PCR等擴增方法聯用，用于檢測突變。

技術領域

本發明屬于核酸檢測技術領域，更具體地說，涉及一種雙脫氧核苷封閉的寡核苷酸的制備方法及其應用。

背景技術

點突變也稱作單堿基替換，指由單個堿基改變發生的突變，可以分為轉換和顛換兩類。轉換是指嘌呤和嘌呤之間的替換或嘧啶和嘧啶之間的替換；顛換是指嘌呤和嘧啶之間的替換。DNA分子中單堿基突變廣泛存在于生物體遺傳信息的編碼中，是導致遺傳性疾病的重要原因之一。就人類基因組而言，在眾多導致人類疾病的基因有義突變、病原體亞型以及耐藥基因的有義突變中，單堿基突變占了相當大的比例，其檢測方法的探索一直是基因診斷研究中的重要課題，特別是對已知有義突變的檢測，將是臨床進行基因診斷的重要手段之一。

單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)，主要是指在染色體基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，而其中最少一種等位基因在群體中的頻率不小于1％。這種多態性只涉及到單個堿基的變異，這種變異可由單個堿基的轉換或顛換所引起，也可由堿基的插入或缺失所致，但通常所說的SNP并不包括后兩種情況。SNP的檢測分析，可應用于醫學上疾病易感性研究，解釋個體間的表型差異對疾病的易感程度；可應用于藥物基因組學及臨床耐藥研究，分析不同基因型個體對藥物反應的差異，指導藥物開發及臨床合理用藥；可應用于種族遺傳學和連鎖不平衡性分析；還在基因組制圖以及遺傳育種等方面有重大意義。

點突變、缺失和插入突變所造成的基因理化特性改變甚微，無疑使與之相關的檢測非常困難，目前對單核苷酸突變位點的檢測技術主要包括：單鏈構象多態性(Single-Strand Conformational Polymorphism，SSCP)技術、異源雙鏈分析(hereroduplexanalysis，HA)技術、變性高效液相色譜法(Denaturing High Performance LiquidChromatography，DHPLC)、變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gelelectrophoresis，DGGE)、化學錯配裂解法(chemical mismatch cleavage，CMC)、焦磷酸序列(Pyrosequencing)分析技術、質譜法(mass spectrometry)、DNA芯片(DNA chip)技術、限制性片段長度多態性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)、等位基因特異性PCR(allele specific PCR，ASPCR)、分子信標(molecular beacons)技術等。這些傳統的檢測方法大多操作復雜、費時繁瑣且特異性、靈敏性及準確性較差。

因此，本領域迫切需要開發簡單、準確和花費少的制備雙脫氧核苷的方法，應用于快速進行基因突變檢測。

發明內容

本發明的目的在于提供簡單、準確和花費少的制備雙脫氧核苷的方法，應用于快速進行基因突變檢測。

本發明的第一方面提供了一種檢測突變體的試劑，所述的試劑包括以下組分：

(a)第一引物，所述第一引物結構如下式I所示：

Z₁-F₁(I)

式中，

F₁為任選的熒光基團或淬滅基團；