[發明專利]一種魚類過敏原的檢測方法

在審

• 申請號: 201711037873.X
• 申請日: 2017-10-31
• 公開（公告）號: CN107918019A
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發明（設計）人: 傅玲琳;王彥波;周瑾茹
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N21/64
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司33224
• 代理人: 黃平英

技術領域

本發明屬于食品分析技術領域和過敏原檢測技術領域，具體涉及一種魚類過敏原的檢測方法。

背景技術

作為品質優良和蛋白含量很高的食物，魚類產品人均年消費量逐年提高，在人類飲食營養架構和健康生活中扮演著越來越重要的角色。近年來，魚類更是作為一種重要的食品調料應用于市場。但是，魚類是FAO公布的八大易引起食物過敏的食品之一。據統計，全球約1％～3％的成年人患有食物過敏性疾病，其中，對魚類過敏的患者占0～1％。

為保證消費者食用安全，幫助易感人群遠離魚類過敏，我國在GB 7718《預包裝食品標簽通則》和GB/T 23779-2009《預包裝食品中的致敏原成分》法典標準列出了包括魚類的八大致敏物質，要求對過敏食品進行過敏原標示。因此，為了建立魚類產品安全生產、評估和標簽標示的體系，對魚類過敏原檢測方法的研究變得愈加重要。膠原蛋白(Collagen)是一種魚類新型過敏原，有較強的過敏原性；小清蛋白(Parvalbumin，PV)也是魚類的主要過敏原，廣泛存在于各類魚中，據研究表明，有95％以上對魚類過敏患者的過敏原屬于小清蛋白。

目前，水產品過敏原檢測方法主要有ELISA、PCR、RT-PCR等技術。這些技術存在檢測時間長、操作復雜、靈敏度和精確度不高等問題。為了保障消費者健康，幫助易感人群規避風險，完善魚類產品過敏原標示體系，建立對魚類過敏原膠原蛋白(Collagen)或魚類過敏原小清蛋白(Parvalbumin，PV)的高效、靈敏、準確的過敏原檢測技術在我國具有重要的應用價值。

發明內容

本發明的主要目的在于提供一種基于抗體技術的近場光波靶向傳感器檢測魚類過敏原的方法，以提高膠原蛋白或魚類小清蛋白的檢測靈敏度和準確度。

一種魚類過敏原的檢測方法，包括如下步驟：

(1)將光纖探頭依次經表面羥基化和表面硅烷化處理后放入過敏原溶液中浸泡，以連接包被過敏原抗原，取出并純水沖洗后浸泡于BSA溶液中以封閉非特異性吸附點；所述魚類過敏原為魚類膠原蛋白或魚類小清蛋白；

(2)用Cy5.5熒光染料標記與所述魚類過敏原對應的單克隆抗體，得標記后的單克隆抗體溶液；

(3)配置不同濃度的魚類過敏原標準品溶液與步驟(2)所得對應的單克隆抗體溶液等體積混合均勻，進行預反應，預反應后的混合液加入樣品池，進樣反應一定時間后，采用步驟(1)處理后的光纖探頭插入樣品池中，采集由近場光波激發的熒光信號值，為了便于不同批次和不同光纖間數據比較，通常對數據進行歸一化處理，公式如下：

并使用4參數的Logistic模型進行模擬得到標準曲線。其公式為：

兩式中，y為信號強度，x為抗原濃度，A1、A2分別為曲線的上、下漸近線，x0為曲線拐點(半抑制濃度)，液濃度作為橫坐標繪制標準曲線；p是拐點處的曲線斜率。

(4)將含過敏原的待測樣品與經步驟(2)處理的抗體溶液等體積混合，預反應后加入樣品池中，進樣反應一定時間后插入經步驟(1)處理后的光線探頭，采用同步驟(3)的方法進行檢測，將采集到的熒光信號值帶入所述標準曲線中，計算得到待測樣品中對應魚類過敏原的濃度。

本發明用Cy5.5熒光染料標記單克隆抗體，通過間接競爭免疫反應，未與待測抗原發生反應的標記抗體被光纖探頭表面固定的包被抗原捕獲，熒光染料在光纖探頭表面近場光波的激發下產生熒光，熒光被光纖探頭收集，根據待測樣品的熒光強度變化與標準曲線對待測中的過敏原的含量進行測定。本發明操作簡便、結果準確、特異性強，能實現對水產品及其制品中痕量小清蛋白的定量檢測，對于促進水產制品過敏原標示體系的發展，保障消費者的健康具有重要意義。

步驟(1)中先用piraha溶液浸泡光纖探頭，使探頭表面羥基化；然后用甲苯溶液和戊二醛溶液浸泡光纖，使探頭表面硅烷化；

優選地，步驟(1)中所述光線探頭為石英光纖探頭。該探頭可通過市購獲得。

優選地，當過敏原為魚類膠原蛋白時，步驟(1)中過敏原溶液的濃度為1.5～3mg/mL；過敏原為魚類小清蛋白時，步驟(1)中過敏原溶液的濃度為1～3mg/mL。

優選地，Cy5.5熒光染料標記單克隆抗體的方法步驟如下：