[發明專利]一種提高鼠李糖脂產量的銅綠假單胞菌及其構建方法

有效

• 申請號: 201711021178.4
• 申請日: 2017-10-27
• 公開（公告）號: CN108060111B
• 公開（公告）日: 2021-06-04
• 發明（設計）人: 朱坤;于海英
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/78;C12P19/44;C12R1/385
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 談杰

本發明涉及一種提高鼠李糖脂產量的銅綠假單胞菌及其構建方法。該菌株的A組中的基因表達量降低或喪失同時B組中的基因表達量升高；A組中的基因選自pslABCDEFGHIJKLMNO胞外多糖合成基因簇、pelABCDEFG多糖合成基因簇、藻酸鹽合成基因簇algD?alg8?alg44?algKEGXLIJF以及聚羥基脂肪酸PHA合成關鍵基因簇phaC1?D?C2中的一個或任意幾個基因的組合；B組中的基因選自rmlACBD、rmlBDAC、rhlYZ、algC、fadD4、lipC以及estA中的一個基因或任意幾個基因的組合。本發明具有顯著提高鼠李糖脂的產量、穩定遺傳以及有利于下游產品的分離純化等優點。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種提高鼠李糖脂產量的銅綠假單胞菌、構建方法和利用其生產鼠李糖脂的方法。

背景技術

鼠李糖脂是一種糖脂類生物表面活性劑，不僅具有化學表面活性劑所具有的物理化學特性，如去垢、乳化、去乳化、發泡和潤濕等作用，最重要的是具有環境友好性，易降解，不會對環境造成二次污染，是目前研究最廣泛的生物表面活性劑之一。在環境治理、農業生產、食品醫藥等領域具有廣泛的潛在應用價值，但其高成本限制了它的大規模生產和應用。

目前，鼠李糖脂的生產菌株主要是銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)，主要存在鼠李糖脂的產量較低和遺傳不穩定等問題。其生產性能的提高一般是通過各種理化誘變或者以質粒載體的方式過量表達某些基因，而這兩種方法都會造成菌株生產性能的不穩定，前者極易發生回復突變，而后者通常還需要添加抗生素，造成環境污染和生產成本的增加，因此迫切需要新的構建鼠李糖脂高產菌株的方法。

鼠李糖脂的代謝途徑比較復雜，在銅綠假單胞菌中，鼠李糖脂的合成依賴于三條代謝途徑，分別為脂質前體β-羥基脂肪酸(HAAs)合成途徑、糖基前體dTDP-L-鼠李糖合成途徑以及將脂質前體和糖基前體進行聚合形成單鼠李糖脂和雙鼠李糖脂。鼠李糖脂合成的中的糖基前體dTDP-L-鼠李糖主要來自于ED途徑，D-葡萄糖-6-磷酸在葡萄糖磷酸變位酶的作用下生成1-磷酸-葡萄糖，然后在rmlABCD的作用下生成dTDP-L-鼠李糖。dTDP-L-鼠李糖除了作為鼠李糖脂合成的前體外，同時也是胞外多糖Psl和藻酸鹽合成的前體，銅綠假單胞菌還會分泌另一種富含葡萄糖殘基的胞外多糖Pel。脂質前體β-羥基脂肪酸(HAAs)一部分來自于脂肪酸的重頭合成途徑，另一部分來自于脂肪酸的β-氧化途徑。羥基脂肪酸除了參與鼠李糖脂的合成外，還參與聚羥基脂肪酸PHA的合成。另外，在銅綠假單胞菌中，鼠李糖脂的合成途徑還受到與群集效應相關的轉錄調控基因和全局性調控因子的控制。這些調控因子與鼠李糖脂代謝途徑緊密關聯，同時外界環境條件，如溫度、通氣量、碳氮源以及微量元素，尤其是鐵都與鼠李糖脂的合成密切相關。正是如此，在現有技術基礎上，要想進一步提高鼠李糖脂具有很大困難。適宜生產鼠李糖脂的生產菌株在構建時，不僅需要考慮鼠李糖脂的產量問題，而且還需要綜合考慮是否穩定遺傳以及下游產品的分離純化等問題。因此，獲得同時具有鼠李糖脂的產量高、可穩定遺傳以及有利于下游產品的分離純化的鼠李糖脂生產菌是很困難的事情。

發明內容

為解決上述技術問題，本發明提供一種提高鼠李糖脂產量的銅綠假單胞菌及其構建方法，該重組銅綠假單胞菌菌株具有顯著提高鼠李糖脂的產量、穩定遺傳以及有利于下游產品的分離純化等優點。利用該重組銅綠假單胞菌生產鼠李糖脂，重組銅綠假單胞菌與作為出發菌的銅綠假單胞菌相比，鼠李糖脂合成能力提高，發酵液澄清不粘稠，發酵液中胞外多糖量減少，后續處理容易，鼠李糖脂純度提高。

本發明解決上述技術問題的技術方案如下：

本發明提供一種提高鼠李糖脂產量的銅綠假單胞菌，該銅綠假單胞菌的A組中的基因表達量降低或喪失，同時，該銅綠假單胞菌的B組中的基因表達量升高；