[發明專利]二苯乙烯苷在制備蛋白激酶N1基因Pkn1減量表達試劑中的應用

有效

• 申請號: 201711016498.0
• 申請日: 2017-10-25
• 公開（公告）號: CN107753492B
• 公開（公告）日: 2021-04-16
• 發明（設計）人: 高寧馨;黃勝;張松影
• 申請（專利權）人: 安徽古爾特科技有限公司
• 主分類號: A61K31/7032
• 分類號: A61K31/7032;A61P25/00;A61P25/28
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二苯乙烯苷是來自于中藥材何首烏的重要活性成分。本申請介紹二苯乙烯苷的一種新功能，通過其對神經細胞系的作用實驗，我們發現二苯乙烯苷的加入能夠降低Pkn1基因的表達水平。Pkn1是細胞表面受體介導的信號轉導通路中的分子開關，而其參與的信號通路與細胞凋亡由密切關系，其變化表征二苯乙烯苷的加入降低了細胞凋亡途徑的信號轉導，對神經細胞的正常代謝起到保護作用。

技術領域

本申請屬于藥材活性成分新功能的技術領域，尤其涉及于一種分離于中藥材何首烏的活性成分可降低神經細胞Pkn1基因表達水平的新功能。

背景技術

蛋白激酶N1，即Pkn1，是一種蛋白激酶，主要參與由G-蛋白偶聯受體所介導的信號轉導過程。該酶能夠被凋亡標志蛋白caspase-3所酶切激活，證明其通路與細胞凋亡存在緊密聯系。細胞凋亡是細胞程序性死亡的一種方式，是細胞面臨外界風險或某種生理階段時所采取的細胞自我死亡的一種機制，而不正常的細胞凋亡往往與不利的生理環境相關聯。

何首烏作為傳統滋補類中藥，使用歷史悠久，且臨床藥效廣泛。何首烏主要含有蒽醌類、二苯乙烯苷類、黃酮類、多糖、卵磷脂、鞣質、微量元素等化學成分，其中二苯乙烯苷被認為是其最重要的水溶性活性物質，已經成為何首烏質量控制的專屬指標。研究表明，何首烏具有抗氧化、抗衰老、心肌保護作用等方面的藥理作用，但同時也有引起肝細胞損傷等方面的毒性作用。但何首烏活性成分，尤其是二苯乙烯苷對中樞神經系統的功能作用目前報道較少。

發明內容

何首烏為常用中藥材，其購自安徽省中醫院藥房。二苯乙烯苷標準品購自上海生工有限公司。

何首烏活性成分的分離過程為：

稱取5.0g何首烏藥材打成粗粉，置于圓底燒瓶中，用75ml的70％乙醇超聲提取30min，超聲結束后抽濾，濾渣再加75ml的70％乙醇超聲提取30 min，超聲結束后抽濾。合并濾液，濃縮至5ml。利用高速逆流色譜進行進一步純化。將試劑按照比例正己烷：乙酸乙酯：乙醇：水＝1：50：1：50置于分液漏斗中充分震蕩，靜置分層，上層作為固定相，下層作為流動相。主機轉速800 r/min，順時針旋轉，紫外檢測波長為280nm。進樣量1mL(樣品濃度按生藥算1g/mL)，根據色譜圖手動收集各色譜峰組分。經比較，何首烏活性成分主要為二苯乙烯苷。所購得二苯乙烯苷的分子式為：

因此，我們以二苯乙烯苷標準品作為研究對象來進行后續的神經系統功能試驗。

二苯乙烯苷的生理活性檢測：

SH-SY5Y細胞為本領域常用神經細胞系，購自上海賽齊生物。培養條件為 37℃5％水平的二氧化碳。培養至36h時，向其中三孔的培養細胞加入終濃度為100μM的二苯乙烯苷，另外三孔加入同樣體積的無菌水作為對照組。繼續培養至96h時，回收細胞。使用本領域常規的技術手段提取細胞中總mRNA、反轉錄為cDNA，并使用Cycle480(Roche)熒光定量PCR儀(使用SybrGreen 染料)對Pkn1的表達量進行定量分析。所使用的PCR條件為：95℃預變性5min，然后是95℃10s，60℃10s，72℃30s擴增共40個循環。所使用的引物為：上游tccccaatcccttgcagagg；下游atcttggtcttactatcctgc。所獲得的定量數值為Pkn1 表達量與內參基因GAPDH的相對比值。

實驗組和對照組所獲得的mRNA相對定量結果如圖1所示。

從圖1中可以看出，經過二苯乙烯苷的處理，Pkn1基因的表達量有所下降，其表達量為對照組的0.8倍。

本申請證明了何首烏活性成分二苯乙烯苷對凋亡相關信號轉導通路的調節作用，該結果意味著二苯乙烯苷可以對生理逆境造成的細胞凋亡傾向有抑制作用，有利于對細胞凋亡信號分子的精細變化的研究。

附圖說明

圖1二苯乙烯苷的添加導致神經細胞系pkn1 mRNA表達水平的變化。