[發明專利]用于檢測EGFR基因19外顯子缺失突變的引物組、試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201711015221.6
• 申請日: 2017-10-25
• 公開（公告）號: CN107574233A
• 公開（公告）日: 2018-01-12
• 發明（設計）人: 張戈;滕祥云;黃少亞
• 申請（專利權）人: 長沙三濟生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及分子檢測技術領域，特別的，涉及一種用于檢測EGFR基因19外顯子缺失突變的引物組、試劑盒及方法。

背景技術

EGFR表皮生長因子受體(EGFR)是原癌基因C-erbB-1(HER-1)的表達產物，定位于細胞膜上。目前已經報道不下30種EGFR基因突變與藥物反應性有關，但絕大部分是外顯子19上的缺失突變。通過對患者EGFR基因的突變檢測，可輔助臨床醫生篩選可受益于分子靶向抗腫瘤藥物如易瑞沙、特羅凱和凱美納等的腫瘤患者。

臨床上大都采用病理組織標本提取DNA進行EGFR檢測，但晚期肺癌病人有時無法獲取腫瘤標本。血液(血漿)腫瘤基因突變檢測方便在不同時間點獲取樣本，沒有空間抽樣偏差，已逐漸在臨床上推廣應用。近年來的研究還表明，癌癥病人的血漿中能否檢測到癌細胞逸出的突變DNA，以及分析血漿中腫瘤基因含量的變化，可以為腫瘤的療效監測及預后提供重要的參考。

采用血漿檢測EGFR基因突變檢測的是來源于腫瘤組織的體細胞突變，不同于檢測一般性的遺傳突變；在血漿中存在大量野生型DNA。傳統的測序法要求突變含量達到20％以上才能有效檢出，因此不適合用于血漿EGFR基因突變檢測。

《非小細胞肺癌血液EGFR基因突變檢測中國專家共識》已于2015年發布，推薦采用突變基因特異擴增PCR法(ARMS法)用于血漿EGFR基因突變檢測。研究表明，19外顯子缺失型中以2種E746-A750del突變型(2235_2249del15和2236_2250del15)最為常見，占到外顯子19缺失總數的70％左右，其它缺失型出現頻率都較低。由于外顯子19上存在大量缺失類型，而ARMS法要求對每種突變類型都設計特異性引物，不能對未知突變類型進行檢測。目前商品化的ARMS法EGFR檢測試劑盒最多只能檢測19種19外顯子缺失型。

肽核酸(Peptide Nucleic Acid，PNA)由丹麥科學家在1991年最先先成。PNA是具有類多肽骨架的DNA類似物，主鏈骨架是由N(2-氨基乙基)-甘氨酸與核酸堿基通過亞甲基羰基連接而成的。PNA/DNA雜交的TM值比DNA/DNA高15℃，但PNA與DNA若有單堿基錯配，則結合能力很弱或不結合。PNA鉗制PCR檢測基因突變的原理是：通過設計一條涵蓋突變位點的15-25bp長的PNA，其序列與野生型序列完全匹配，當PCR的模板為野生型時，PNA與其完全匹配，引物延伸受阻，擴增可受到強烈地抑制；而當PCR的模板為突變型時，PNA與其存在哪怕是一個堿基的錯配，兩者間的雜交能力急劇下降或完全消失，引物延伸不受影響，擴增可以正常進行。

發明內容

本發明的目的是提供一種用于檢測EGFR基因19外顯子缺失突變的引物組、試劑盒及方法，針對EGFR基因的19號外顯子區域，在缺失突變位置兩端的保守區域設計一對PCR引物，在PCR上游引物3’端附近的保守區域設計一條探針；在缺失突變位置設計一條與EGFR野生型基因完全匹配的PNA序列，基于PNA鉗制PCR檢測基因突變的原理對腫瘤組織標本或血液(血漿)中提取的DNA進行檢測，具有檢測速度快、檢測類型多及靈敏度高的優點。具體地：

本發明提供一種用于檢測EGFR基因19外顯子缺失突變的引物組，所述引物組包括擴增引物對、探針及PNA，其中：

所述擴增引物對序列如下：

正向引物：5’-TCCCAGAAGGTGAGAAAGT-3’；

反向引物：5’-GGATTTCCTTGTTGGCTTT-3’；

所述探針序列為：FAM-5’-ATTCCCGTCGCTATC-3’-MGB；

所述PNA序列為：

NH₂-5’-GATGTTGCTTCTCTTAATTCC-3’-COOH。

本發明同時提供一種用于檢測EGFR基因19外顯子缺失突變的試劑盒，所述試劑盒包括兩套PCR反應體系，第一套PCR反應體系包括針對EGFR基因19外顯子野生型和缺失突變檢測設計的擴增引物對及探針，其中：

所述擴增引物對序列如下：

正向引物：5’-TCCCAGAAGGTGAGAAAGT-3’；

反向引物：5’-GGATTTCCTTGTTGGCTTT-3’；

所述探針序列為：FAM-5’-ATTCCCGTCGCTATC-3’-MGB；

所述第一套PCR反應體系還包括2×PCRbuffer、DNA模板和去離子水；