[發明專利]一種青霉素酰化酶固定化載體及其制備方法

在審

• 申請號: 201711015061.5
• 申請日: 2017-10-25
• 公開（公告）號: CN107916259A
• 公開（公告）日: 2018-04-17
• 發明（設計）人: 陳振斌;王旭東;李軻;張霞云;段成龍;賈偉煒
• 申請（專利權）人: 蘭州理工大學
• 主分類號: C12N11/02
• 分類號: C12N11/02;C12N11/14
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司11385
• 代理人: 董芙蓉

技術領域

本發明屬于材料科學與工程領域，涉及一種青霉素酰化酶固定化載體及其制備方法。

背景技術

固定化酶(Immobilized enzyme)是20世紀60年代發展起來的一種新技術。所謂固定化酶，是指在一定的空間范圍內起催化作用，并能反復和連續使用的酶。酶法生產6-氨基青霉素烷酸(6-Aminopenicillanic acid,6-APA)工藝的核心問題是高效固定化青霉素酰化酶(Penicillin G acylase,PGA)的制備技術，而載體材料的設計與制備是PGA固定化技術的關鍵所在。

因此，本專利結合各方面因素，制備出一種成本低廉，物理化學穩定性好及有機溶劑耐受性強的的酶固定化載體。

發明內容

本發明的目的在于合成一種酶的載體，通過對工藝條件的優化制備出酶活回收率高的固定化酶。

載體通過表面修飾，使其表面能夠以化學鍵合的方式，通過共價鍵合固定化酶。提高固定化酶的分散性和穩定性。

一種青霉素酰化酶固定化載體，其特征在于，通過戊二醛對載體表面進行修飾，使戊二醛的醛基與TiO₂表面的羥基通過縮醛反應結合在一起，而另一端的醛基則作為靶點，用于與PGA分子聚集體外表面的氨基通過希曼反應固定化PGA；該專利方法所制得的固定化PGA活力范圍為11000-14000U/g、對應游離酶負載量范圍13000-15000U/g、酶活回收率的范圍為80-90％，重復使用12次后，其酶活保留率為60％。

一種本發明青霉素酰化酶固定化載體的制備方法，包括以下步驟：

)將TiO₂在120℃活化24小時。

2)取體積比為1:10的戊二醛無水乙醇溶液，按固液比1:16的比例加入活化TiO₂，恒溫水浴機械攪拌24小時。產物沖洗至加入比例量的鹽酸羥胺(殘液：2％的HO-NH₂.HCl＝5:1)，于50℃反應20分鐘后，在238nm處的吸光度小于0.003，然后將產物過濾，置于室溫下晾干即得到酶固定化載體。

2)固定化PGA

稱取上述合成的載體，加入到反應器中，再加入60倍載體質量的1％(原酶溶液按體積比稀釋至1％)的游離PGA酶液，密封，在25℃條件下避光震蕩24小時；分離游離酶殘液，固定化PGA用磷酸鹽緩沖液沖洗，直到洗滌液中加入青霉素G，并用PDAB顯色3min后，測的溶液的吸光度小于0.003為止；放入35℃真空烘箱干燥至恒重，得固定化PGA。

與現有技術相比，本發明的有益效果為：

本發明合成了一種價格低廉，物理化學穩定性好、有機溶劑耐受性強和較便于分離回收的酶固定化載體。使得固定化酶熱穩定性，pH穩定性，回收率以及重復使用性較游離酶都有較大的提高。

附圖說明

圖1是固定化PGA的流程圖；

圖2是載體制備的反應式；

圖3是固定化PGA反應式。

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施例對本發明的技術方案作進一步詳細地說明。

1.改性TiO₂的檢測

反應結束后，將改性TiO₂體系中的離心上清液用蒸餾水稀釋910倍，取一定量的稀釋液加0.2倍稀釋液體積的濃度為2％的鹽酸羥胺溶液，于50℃下反應20分鐘后加入比色皿，以蒸餾水做參比，在波長238nm處測吸光度。并以加入到反應體系中的原始戊二醛作對照液，在不加TiO₂的情況下，將原始戊二醛在相同條件下處理，以消除因戊二醛的自然氧化二產生的誤差。戊二醛接枝率G按以下公式(1)計算：

其中C₀為對照實驗所得的戊二醛的濃度，C₁為殘液中戊二醛的濃度，V為反應體系的體積，m為二氧化鈦質量。

2.青霉素酰化酶的固定化及酶活力、酶負載量、酶活回收率的測定

固定化稱取上述合成的載體，加入到反應器中，再加入60倍載體質量的1％(原酶溶液按體積比稀釋至1％)的游離PGA酶液，密封，在25℃條件下避光震蕩24小時；分離游離酶殘夜，固定化PGA用磷酸鹽緩沖液沖洗，直到洗滌液中加入青霉素G，并用PDAB顯色3min后，測的溶液的吸光度小于0.003為止；放入35℃真空烘箱干燥至恒重，得固定化PGA。