[發明專利]一種口含型煙草制品對變形鏈球菌影響的檢測方法

在審

• 申請號: 201710988312.1
• 申請日: 2017-10-21
• 公開（公告）號: CN107523645A
• 公開（公告）日: 2017-12-29
• 發明（設計）人: 高茜;管瑩;楊柳;米其利;朱洲海;徐玉瓊;陸舍銘;夭建華
• 申請（專利權）人: 云南中煙工業有限責任公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06;C12R1/46
• 代理公司: 昆明正原專利商標代理有限公司53100
• 代理人: 金耀生,于洪

1.一種口含型煙草制品對變形鏈球菌影響的檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟（1），配制人工唾液，并向人工唾液中添加變形鏈球菌，使變形鏈球菌在人工唾液中的量為1*10⁴-1*10⁶CFU/mL，得到含變形鏈球菌的人工唾液；

步驟（2），采用步驟（1）得到的含變形鏈球菌的人工唾液對口含煙煙草制品進行提取，提取多次，分別收集提取液；

步驟（3），將步驟（2）收集到的各提取液與步驟（1）的含變形鏈球菌的人工唾液一起放入厭氧培養箱于37℃下進行共培養；之后分別提取各培養液中的變形鏈球菌DNA，同時提取變形鏈球菌的標準菌株原始DNA；

步驟（4），以濃度梯度稀釋10倍的變形鏈球菌的標準菌株原始DNA作為模板進行熒光定量PCR分析，之后繪制變形鏈球菌熒光定量PCR標準曲線；

同時，分別以各培養液中的變形鏈球菌DNA作為模板進行熒光定量PCR分析，空白對照模板采用滅菌雙蒸水，根據標準曲線計算各培養液中的變形鏈球菌DNA的含量；

其中，熒光定量PCR分析所使用的上游引物為5’-gcctacagctcagagatgctattct-3’；下游引物為5’-gccatacaccactcatgaattga-3’；探針為FAM-tggaaatgacggtcgccgttatgaa-TAMRA。

2.根據權利要求1所述的口含型煙草制品對變形鏈球菌影響的檢測方法，其特征在于，步驟（2）的具體方法為：

向口含煙煙草制品0.8-1.2g中注入步驟（1）的含變形鏈球菌的人工唾液于37℃下恒溫震蕩進行提取，提取多次，每次提取所用的含變形鏈球菌的人工唾液10mL，每次提取時間為5min，分別收集提取液h。

3.根據權利要求2所述的口含型煙草制品對變形鏈球菌影響的檢測方法，其特征在于，所述的震蕩速度為150-300 rpm；提取次數為3次。

4.根據權利要求2所述的口含型煙草制品對變形鏈球菌影響的檢測方法，其特征在于，步驟（3）的具體方法為：

（3.1）共培養：取步驟（2）收集到的各提取液與步驟（1）的含變形鏈球菌的人工唾液，每種液體均分為3等份，分別放入厭氧培養箱于37℃下進行共培養，每種液體3等份的培養時間分別為0h、2h、6h三個時間段；

（3.2）培養液中的變形鏈球菌DNA的提取：取出步驟（3.1）的培養后的培養液在4℃離心，去上清液，再加入微生物PCR裂解液，混合均勻后，置于75-85℃下熱變性15min，然后再次離心，取上清液，即得到培養液中的變形鏈球菌DNA；所述的微生物PCR裂解液的加入體積為培養液體積的5%；

（3.3）變形鏈球菌的標準菌株原始DNA的提取：取與步驟（3.2）所使用的相同體積的微生物PCR裂解液，加入變形鏈球菌的標準菌株至濃度為10⁷ CFU/mL，在75-85℃下熱變性15min，然后離心，取上清液，即得到變形鏈球菌的標準菌株原始DNA；

所述的微生物PCR裂解液為Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR。

5.根據權利要求4所述的口含型煙草制品對變形鏈球菌影響的檢測方法，其特征在于，（3.2）中培養液的離心的轉速為11000-12000r/min，時間為10min；熱變性后離心的轉速為800-1000r/min，時間為1min。

6.根據權利要求4所述的口含型煙草制品對變形鏈球菌影響的檢測方法，其特征在于，（3.3）中熱變性后離心的轉速為800-1000r/min，時間為10s。

7.根據權利要求1或4所述的口含型煙草制品對變形鏈球菌影響的檢測方法，其特征在于，在進行熒光定量PCR分析前需要對變形鏈球菌的標準菌株原始DNA、各培養液中的變形鏈球菌DNA的純度判定，判定方法是：將待測樣品的DNA分別在波長260nm、280nm下測定的光密度值；當在波長260nm下光密度值與在波長280nm下光密度值的比值為1.7~1.9時，表明純度合格，能進行熒光定量PCR分析，反之，則表明純度不合格，不能進行熒光定量PCR分析。