[發(fā)明專利]一種提高膠乳免疫比濁法抗原過(guò)剩和線性范圍的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710986970.7
• 申請(qǐng)日: 2017-10-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107894509A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-04-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王釗;王金鳳;蔣欣
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 柏榮診斷產(chǎn)品（上海）有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68
• 代理公司: 成都頂峰專利事務(wù)所(普通合伙)51224
• 代理人: 趙正寅

本發(fā)明公開(kāi)了一種提高膠乳免疫比濁法抗原過(guò)剩和線性范圍的方法，包括以下步驟：步驟一、將在膠乳溶液中加入蒸餾水進(jìn)行錯(cuò)流過(guò)濾；步驟二、將置換蒸餾水后的膠乳溶液加入到反應(yīng)釜中，加入氯化鋰和十二烷基苯磺酸鈉并攪拌混勻；然后通入氬氣或氮?dú)馊コ鯕夂螅尤脒^(guò)硫酸鉀，二次引發(fā)微球內(nèi)部的收斂聚合反應(yīng)；步驟三、將完成收斂聚合反應(yīng)后的膠乳溶液加入膠乳試劑標(biāo)記反應(yīng)需要的緩沖液進(jìn)行錯(cuò)流過(guò)濾。該方法從膠乳顆粒層面入手，通過(guò)相對(duì)簡(jiǎn)單的可放大工藝，直接對(duì)膠乳顆粒進(jìn)行了二次收斂聚合改進(jìn)，不涉及抗體親和力改進(jìn)，不增加原料成本，適用范圍廣，有效減少了寬線性高抗原過(guò)剩項(xiàng)目開(kāi)發(fā)的難度，提高了膠乳免疫比濁法抗原過(guò)剩和線性范圍。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于體外診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高膠乳免疫比濁法抗原過(guò)剩和線性范圍的方法。

背景技術(shù)

體外診斷領(lǐng)域，膠乳免疫比濁試劑盒中通常將抗體或抗原標(biāo)記在功能化膠乳微球表面，在一定的緩沖溶液中與被測(cè)抗原或抗體反應(yīng)，形成抗原抗體膠乳微球復(fù)合物，帶來(lái)吸光度信號(hào)值變化。使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品繪制信號(hào)值與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)定未知濃度樣品時(shí)，由全自動(dòng)分析儀器根據(jù)樣品所得信號(hào)值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，計(jì)算出被測(cè)物濃度。

抗原過(guò)剩(安全區(qū))和線性范圍是免疫比濁試劑盒最重要的性能指標(biāo)之一。根據(jù)海登博格原理，抗原過(guò)剩是免疫比濁試劑實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)的前提和范圍，即在抗原過(guò)剩范圍內(nèi)才可以定量報(bào)告結(jié)果，是線性范圍的前提。線性范圍指被測(cè)物含量的測(cè)定結(jié)果與被測(cè)物含量(通常為稀釋估算值)成直線比例關(guān)系的能力。抗原過(guò)剩范圍是指高因Hook效應(yīng)，樣本測(cè)定結(jié)果不低于線性范圍上限的最高濃度值。

大多數(shù)試劑盒的說(shuō)明書都會(huì)注明，超過(guò)線性范圍上限的樣本需要進(jìn)行稀釋復(fù)測(cè)，復(fù)測(cè)結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)得到該樣本結(jié)果。

抗原過(guò)剩范圍小，則臨床上超過(guò)抗原過(guò)剩范圍的病患樣本，其測(cè)定結(jié)果因?yàn)镠ook效應(yīng)，低于線性范圍不會(huì)提示醫(yī)生需要稀釋復(fù)檢，從而濃度被低估；甚至更嚴(yán)重的出現(xiàn)低于陽(yáng)性參考值，假陰性的情況，導(dǎo)致誤診和漏診發(fā)生。線性范圍上限越高，需要稀釋復(fù)檢的樣本少，減少了醫(yī)院測(cè)試成本和人力需求。

診斷項(xiàng)目中，有不少項(xiàng)目需要寬線性范圍，同時(shí)，抗原過(guò)剩要求極高。如重要的炎癥標(biāo)志物C反應(yīng)蛋白(CRP)，線性范圍上限一般要達(dá)到320mg/L，抗原過(guò)剩范圍不低于1000mg/L。腎病標(biāo)志物微量白蛋白(Malb)，線性范圍上限一般要達(dá)到400mg/L，甚至1000mg/L，抗原過(guò)剩范圍不低于50000mg/L。免疫系統(tǒng)指標(biāo)血液免疫球蛋白G(IgG)，線性范圍上限一般要達(dá)30g/L，甚至到60g/L，抗原過(guò)剩范圍不低于400g/L。腫瘤標(biāo)志物甲胎蛋白(AFP)，線性范圍上限一般要求達(dá)到250ng/ml，甚至1000ng/ml，抗原過(guò)剩范圍不低于20萬(wàn)ng/ml(初篩)，甚至治療監(jiān)測(cè)用的試劑需要不低于100萬(wàn)ng/ml。

本領(lǐng)域技術(shù)人員在膠乳免疫比濁中常規(guī)提高抗原過(guò)剩以及線性范圍的方式，為增加抗體使用量或減少樣本量。

增加抗體使用量在一定范圍內(nèi)可以提高線性和抗原過(guò)剩范圍，但在其他條件不變情況下，該方案即提高了試劑成本，又只能在較小幅度使用。同時(shí)由于增加抗體量帶來(lái)的微球表面抗體密度提高，會(huì)導(dǎo)致試劑靈敏度提升。在檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)范圍有限的情況下，靈敏度和線性范圍互相制約，當(dāng)靈敏度高到一定程度后，就算降低增敏劑用量至零，仍然會(huì)因?yàn)閮x器吸光度檢測(cè)范圍有限，儀器無(wú)法區(qū)分高濃度樣本的信號(hào)差異，限制了線性范圍和抗原過(guò)剩范圍。

樣本量減少，在儀器技術(shù)無(wú)重大突破情況下，也是有限度的，而且減少樣本量，試劑靈敏度將大幅度降低。

非常規(guī)的提高抗原過(guò)剩和線性范圍的技術(shù)包括以下兩種：

一是本申請(qǐng)人在申請(qǐng)?zhí)枮?01610227990.1的專利中公開(kāi)的技術(shù)方案，在一些項(xiàng)目中，使用非常嚴(yán)苛的條件，可在可控成本的情況下實(shí)現(xiàn)高性能的膠乳免疫比濁試劑。主要是基于儀器預(yù)稀釋功能，使用特定粒徑微球，特定用量的特定抗體，控制樣本/抗體比實(shí)現(xiàn)的。該方案需要針對(duì)不同的項(xiàng)目進(jìn)行試劑研發(fā)，研發(fā)周期較長(zhǎng)，研發(fā)工作量大。