[發(fā)明專利]一種利用大腸桿菌生產腸桿菌肽的工藝及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710986420.5
• 申請日: 2017-10-20
• 公開（公告）號: CN107523529B
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發(fā)明（設計）人: 譙仕彥;郭文江;丁修良;張明;劉揚科;王學瑞;楊彩霞;何濤;吳保慶
• 申請（專利權）人: 林州中農穎泰生物肽有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/01;C12P21/00;C07K1/30;C07K1/34;C07K1/16;C07K1/14;C07K1/36;A23K20/147;C12R1/19
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司 41109
• 代理人: 張春

技術領域

本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術領域，具體涉及一種利用大腸桿菌生產腸桿菌肽的工藝及其應用。

背景技術

乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、玉米粉、玉米淀粉、玉米漿干粉、玉米漿等是常用的發(fā)酵工業(yè)用碳源。牛骨蛋白胨、魚蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酪蛋白胨、蛋白胨、水解乳蛋白、酵母膏、酵母浸粉、酵母粉、牛肉膏、牛肉浸粉、大豆粕粉、大豆餅粉等是常用的發(fā)酵工業(yè)用氮源。碳源、氮源、無機鹽和微量元素、生長因子是組成基礎發(fā)酵生產培養(yǎng)基的成分。通過在基礎發(fā)酵生產培養(yǎng)基中補充碳源、氮源，進行補料分批高密度發(fā)酵工藝優(yōu)化，可以顯著提高生物發(fā)酵效價，降低發(fā)酵原料成本，縮短發(fā)酵生產周期，具有工藝簡單、適合大規(guī)模工業(yè)化生產等特點。

近年來隨著抗生素的大量使用，細菌耐藥性不斷形成，致使現有抗菌藥物對細菌感染治療的療效低下或無效，形成的危害日益嚴重。如何克服細菌的耐藥性是當前的研究重點和熱點，科研工作者們正努力尋求新的抗菌策略，這迫切需要開發(fā)出新型的抗菌制劑。高效、低毒、不易形成耐藥性的抗菌肽作為最有希望代替抗生素的新藥制劑倍受國內外科研工作者的關注。

目前國內外對于腸桿菌肽的研究，除了申請人（中農穎泰集團）進入量產階段外，大部分還是部分科學院校處于實驗室初步研究階段，有關其報道和文獻幾乎沒有。申請人的技術團隊經過幾年專心研究，已經成功的從實驗室研究階段進入到了大批量生產階段，腸桿菌肽的發(fā)酵生產、分離純化技術目前在國內外處于領先水平。腸桿菌肽在臨床上主要治療畜禽由于大腸桿菌、沙門氏菌等引起的腹瀉，隨著腸桿菌肽的工業(yè)化生產的實現，逐步會減少、替代抗生素在治療畜禽腹瀉方面的應用。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是為了解決現有技術中存在的不足之處，提供一種利用大腸桿菌生產腸桿菌肽的工藝及其應用。

本發(fā)明的目的是以下述方式實現的：

一株大腸桿菌ZNYT2，所述大腸桿菌ZNYT2保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位簡稱：CGMCC，保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期：2016年8月23日，保藏編號為：CGMCC NO. 12902，分類命名：大腸埃希氏菌。

一種利用如上述的大腸桿菌ZNYT2生產腸桿菌肽的工藝，包括以下步驟：

（1）菌種的分離：通過對戶外采集樣本的富集以及初篩、復篩，從初篩菌株中篩選出產生的抑菌物質能夠很好的耐受高溫和蛋白酶處理，而且菌株生長迅速，抑菌圈大且明顯的菌株S49-2，命名為益生大腸桿菌ZNYT2；

（2）菌種的誘變：將分離得到的益生大腸桿菌ZNYT2原始菌株擴大培養(yǎng)后，配制成菌懸液后，先利用氦氖激光對菌懸液中的菌株進行誘變，經過培養(yǎng)和篩選，挑出生長快速、透明圈直徑大的菌株，再利用紫外亞硝基胍進行復合誘變，經過培養(yǎng)和初篩，挑出生長快速、透明圈直徑大的菌株，進行復篩，獲得穩(wěn)定高產菌株；

（3）菌種的擴大培養(yǎng)

將步驟（2）中得到的穩(wěn)定高產大腸桿菌ZNYT2進行菌種活化、搖瓶培養(yǎng)和種子罐培養(yǎng)，獲得種子發(fā)酵液；

（4）發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)

將步驟（3）中得到的種子發(fā)酵液接種于發(fā)酵罐中的發(fā)酵罐培養(yǎng)基上，進行發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液；

（5）對步驟（4）中得到的發(fā)酵液進行后處理，獲得腸桿菌肽

a. 雙效濃縮；利用雙效分離器在真空條件下進行濃縮；

b. 醇沉：將雙效濃縮后的發(fā)酵液的含醇量調至體積分數為65%-85%，于4℃下進行醇沉；

c. 離心：將醇沉后的發(fā)酵液進行離心分離，收集上清液；

d. 脫色：將離心后的上清液經過氧化鋁滲漉柱進行脫色；

e. 醇回收：回收經過脫色后的發(fā)酵液中的乙醇至無醇味；

f. 鹽析：向經過醇回收后的發(fā)酵液中加入硫酸銨，變加邊攪拌，加完硫酸銨后繼續(xù)攪拌1-2h，靜置12-15h，離心，收集沉淀，多肽的鹽析分離采用飽和硫酸銨溶液法；根據硫酸銨飽和度溶液表可知，1L發(fā)酵液加入767g硫酸銨固體；

g. 微濾：將收集到鹽析沉淀進行復溶，溶劑為體積分數為20%的乙醇溶液，再將復溶后的溶液通過0.45μm微濾濾膜進行微濾，收集微濾液；

h. 柱層析分離：利用層析柱對微濾液進行柱層析分離，采用梯度洗脫法，收集洗脫液；

i. 超濾：將柱層析的洗脫液通過1000Da超濾膜進行超濾，收集截留液；

j. 凍干：對超濾后的截留液進行低溫真空冷凍干燥，即得腸桿菌肽純品。

所述步驟（5）中的h步驟中所用層析柱為BPG200/500層析柱。