[發(fā)明專利]一種利用大腸桿菌生產(chǎn)腸桿菌肽的工藝及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710986420.5
• 申請日: 2017-10-20
• 公開（公告）號: CN107523529B
• 公開（公告）日: 2021-03-12
• 發(fā)明（設計）人: 譙仕彥;郭文江;丁修良;張明;劉揚科;王學瑞;楊彩霞;何濤;吳保慶
• 申請（專利權(quán)）人: 林州中農(nóng)穎泰生物肽有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N15/01;C12P21/00;C07K1/30;C07K1/34;C07K1/16;C07K1/14;C07K1/36;A23K20/147;C12R1/19
• 代理公司: 鄭州中原專利事務所有限公司 41109
• 代理人: 張春

1.一株大腸桿菌ZNYT2，其特征在于：所述大腸桿菌ZNYT2保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位簡稱：CGMCC，保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保藏日期：2016年8月23日，保藏編號為：CGMCC NO. 12902，分類命名：大腸埃希氏菌。

2.一種利用如權(quán)利要求1所述的大腸桿菌ZNYT2生產(chǎn)腸桿菌肽的工藝，其特征在于，包括以下步驟：

（1）菌種的分離：通過對戶外采集樣本的富集以及初篩、復篩，從初篩菌株中篩選出產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)能夠很好的耐受高溫和蛋白酶處理，而且菌株生長迅速，抑菌圈大且明顯的菌株S49-2，命名為益生大腸桿菌ZNYT2；

（2）菌種的誘變：將分離得到的益生大腸桿菌ZNYT2原始菌株擴大培養(yǎng)后，配制成菌懸液后，先利用氦氖激光對菌懸液中的菌株進行誘變，經(jīng)過培養(yǎng)和篩選，挑出生長快速、透明圈直徑大的菌株，再利用紫外亞硝基胍進行復合誘變，經(jīng)過培養(yǎng)和初篩，挑出生長快速、透明圈直徑大的菌株，進行復篩，獲得穩(wěn)定高產(chǎn)菌株；

（3）菌種的擴大培養(yǎng)

將步驟（2）中得到的穩(wěn)定高產(chǎn)大腸桿菌ZNYT2進行菌種活化、搖瓶培養(yǎng)和種子罐培養(yǎng)，獲得種子發(fā)酵液；

（4）發(fā)酵罐中發(fā)酵培養(yǎng)

將步驟（3）中得到的種子發(fā)酵液接種于發(fā)酵罐中的發(fā)酵罐培養(yǎng)基上，進行發(fā)酵培養(yǎng)獲得發(fā)酵液；

（5）對步驟（4）中得到的發(fā)酵液進行后處理，獲得腸桿菌肽

a. 雙效濃縮；利用雙效分離器在真空條件下進行濃縮；

b. 醇沉：將雙效濃縮后的發(fā)酵液的含醇量調(diào)至體積分數(shù)為65%-85%，于4℃下進行醇沉；

c. 離心：將醇沉后的發(fā)酵液進行離心分離，收集上清液；

d. 脫色：將離心后的上清液經(jīng)過氧化鋁滲漉柱進行脫色；

e. 醇回收：回收經(jīng)過脫色后的發(fā)酵液中的乙醇至無醇味；

f. 鹽析：向經(jīng)過醇回收后的發(fā)酵液中加入硫酸銨，變加邊攪拌，加完硫酸銨后繼續(xù)攪拌1-2h，靜置12-15h，離心，收集沉淀，多肽的鹽析分離采用飽和硫酸銨溶液法；根據(jù)硫酸銨飽和度溶液表可知，1L發(fā)酵液加入767g硫酸銨固體；

g. 微濾：將收集到鹽析沉淀進行復溶，溶劑為體積分數(shù)為20%的乙醇溶液，再將復溶后的溶液通過0.45μm微濾濾膜進行微濾，收集微濾液；

h. 柱層析分離：利用層析柱對微濾液進行柱層析分離，采用梯度洗脫法，收集洗脫液；

i. 超濾：將柱層析的洗脫液通過1000Da超濾膜進行超濾，收集截留液；

j. 凍干：對超濾后的截留液進行低溫真空冷凍干燥，即得腸桿菌肽純品。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)腸桿菌肽的工藝，其特征在于：所述步驟（5）中的h步驟中所用層析柱為BPG200/500層析柱。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生產(chǎn)腸桿菌肽的工藝，其特征在于：所述步驟（5）中的h步驟中柱層析分離的具體步驟為：

（1）先用純水沖洗柱子至基線平衡；Buffer A沖洗柱子2CV；

（2）加載樣品，上樣量為一倍的柱體積；

（3）Buffer A平衡柱子3CV；

（4）Buffer B 0-100%線性梯度洗脫，觀察電導變化及譜圖，收集目標物質(zhì)峰；

（5）Buffer B 3CV沖洗柱子至基線及電導降到純水電導為止，準備下一次上樣；

緩沖液： BufferA：1M/L氯化鈉；BufferB：純水；

樣品溶液的配制：腸桿菌肽用體積分數(shù)為20%乙醇溶液進行溶解，用藥用級氯化鈉調(diào)電導至55ms/cm。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的工藝生產(chǎn)得到的腸桿菌肽。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的工藝所制備的腸桿菌肽在飼料領域中的應用。