[發明專利]一種痕量異硫氰酸酯的簡便測定方法

在審

• 申請號: 201710984608.6
• 申請日: 2017-10-20
• 公開（公告）號: CN107831251A
• 公開（公告）日: 2018-03-23
• 發明（設計）人: 吳元鋒;申雨珂;朱葉;應嘉敏;劉士旺;毛建衛
• 申請（專利權）人: 浙江科技學院
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙)33213
• 代理人: 沈淵琪

技術領域

本發明屬于化學分析技術領域，具體涉及一種痕量異硫氰酸酯的簡便測定方法。

背景技術

異硫氰酸酯(ITCs)是一種小分子物質，其包括芐基異硫氰酸酯（BITC），苯乙基異硫氰酸酯（PEITC）和蘿卜硫素（SF）等，在包西蘭花、卷心菜、芥蘭、花莖橄欖和孢子甘藍等十字花科蔬菜中含量比較豐富。當植物細胞受損時，存在植物的細胞空泡中的硫代葡萄糖苷（glucosinolate）會被黑芥子硫苷酶（myrosinase）水解，產生ITCs。流行病學資料顯示，十字花科蔬菜中的ITCs對胃癌、乳腺癌、肝癌 、食道癌 、肺癌等癌細胞增殖具有明顯的阻斷作用。

ITCs分子-N=C=S基團中的C有高度的親電性，所以能夠與親核試劑發生親核加成反應。硫醇、氨基、羥基、羧酸、β-羰基等都能作為親核試劑與ITCs發生親核加成反應，生成相應的硫脲。因此，當樣品中存在蛋白質等物質時，ITCs能夠與蛋白質形成加合物。

已經有多種ITCs的分析方法，如可通過液相色譜或氣相色譜法分析。但是氣相色譜法測定時，ITCs在氣化室中會部分發生分解，造成結果不準確；液相色譜法的檢出限較低，不適宜用于痕量ITCs的檢測。當ITCs濃度很低時，一般用環縮合法分析。環縮合法的原理是ITCs與1,2-苯二硫醇形成1,3-benzodithiole-2-thione，再通過液相色譜法分析ITCs的總量。環縮合法具有操作簡單、靈敏度高的優點（最低檢出限可達nmol級，遠低于氣相和液相色譜法直接分析），但是直接分析動物糞便或組織水提液中ITCs含量時，由于ITCs會與樣品中的蛋白質等形成加合物，ITCs測定值會小于實際值；用有機溶劑萃取法時，有機溶劑會干擾環縮合反應，造成結果不準確，因此用有機溶劑萃取后，需要蒸發除去有機溶劑，再加入水溶解后分析，步驟較為繁瑣。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供一種痕量異硫氰酸酯的簡便測定方法的技術方案。

所述的一種痕量異硫氰酸酯的簡便測定方法，其特征在于包括以下步驟：取待測樣品水提液加入過量GSH溶液或Cys溶液，混勻，在室溫下靜置10～20min，然后在7000～10000g離心10～20min除去沉淀，再用環縮合法分析上清液中ITCs含量。

所述的一種痕量異硫氰酸酯的簡便測定方法，其特征在于所述的GSH溶液或Cys溶液濃度為100～130mM，加入比例V（待測樣品水溶液）：V（GSH溶液或Cys溶液）為100:1～150:1。

上述的一種痕量異硫氰酸酯的簡便測定方法，設計合理，通過加入過量的還原型谷胱甘肽（GSH）或半胱氨酸（Cys），使ITCs與GSH或Gys形成加合物，再通過環縮合法分析其ITCs的含量，提高了ITCs的分析準確度。

上述的一種痕量異硫氰酸酯的簡便測定方法，ITCs有蘿卜硫素（SF）、、Erucin、苯乙基異硫氰酸酯（PEITC）、芐基異硫氰酸酯（BITC）等。

上述的一種痕量異硫氰酸酯的簡便測定方法，主要用于含有蛋白質，并且ITCs濃度很低樣品的檢測，主要樣品有血液、腸道內容物、糞便或植物組織等。

具體實施方式

以下實施例來進一步說明本發明。

實施例1

20ml待測樣品，含有20μM的蘿卜硫素（一種ITCs）和2mg/ml的酪蛋白。溶液中加入200μl，110mM的GSH溶液，混勻后靜置20min。8000g離心20min，取上清液液進行環縮合反應，具體步驟為：取200μl上清液，加入400μl，20mM的BDT，65℃反應2h，冷卻后微濾膜過濾，高效液相色譜法分析其產物的含量，液相條件為流動相甲醇:水=80:20，柱溫30℃，流速為1ml/min，進樣量為10μl。液相分析結果表明，加入GSH的樣品，ITCs濃度測定值為19.9μM；而同等條件下，不加GSH的樣品，ITCs濃度測定值為13.6μM，加入GSH后ITCs含量顯著升高，接近實際濃度。

實施例2

20ml待測樣品，含有20μM的苯乙基異硫氰酸酯（PEITC，一種ITCs）和2mg/ml的酪蛋白。溶液中加入150μl，110mM的Cys溶液，混勻后靜置10min。10000g離心10min，取上清液液按照實施例1方法進行環縮合反應，再通過實施例1的方式進行液相分析。結果表明，加入Cys的樣品，ITCs濃度測定值為19.8μM；同等條件下不加Cys的樣品，ITCs濃度測定值為13.7μM，加入Cys后ITCs含量顯著升高，接近實際濃度。

實施例3

20ml待測樣品，含有20μM的PEITC和0.2g的小鼠糞便。溶液中加入200μl，110mM的GSH溶液，混勻后靜置20min。9000g離心10min，取上清液液按照實施例1方法進行環縮合反應，再通過實施例1的方式進行液相分析。結果表明，加入GSH的樣品，ITCs濃度測定值為18.9μM；同等條件下不加GSH的樣品，ITCs濃度測定值為9.6μM，加入GSH后ITCs含量顯著升高，接近實際濃度。