[發(fā)明專利]一種基于大數(shù)據(jù)的直緣烏頭DNA條形碼及直緣烏頭的鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710980336.2
• 申請(qǐng)日: 2017-10-19
• 公開（公告）號(hào): CN107630014B
• 公開（公告）日: 2018-08-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊俊波;何俊;王家艷;王紅;李德銖
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所
• 主分類號(hào): C12N15/11
• 分類號(hào): C12N15/11;C12Q1/6895
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 劉奇

本發(fā)明公開了一種基于大數(shù)據(jù)的直緣烏頭DNA條形碼及直緣烏頭的鑒定方法，屬于分子鑒定技術(shù)領(lǐng)域。通過廣泛調(diào)查直緣烏頭的野外分布區(qū)、主要栽培區(qū)、野外同域分布物種以及近緣藥用物種的資料信息，然后盡可能的進(jìn)行多個(gè)地方采樣，構(gòu)建樣品的DNA條形碼大數(shù)據(jù)庫，比較并發(fā)現(xiàn)直緣烏頭特有的序列信息位點(diǎn)，進(jìn)一步獲得其特有的可用于鑒定的DNA條形碼。所述DNA條形碼為由引物序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2擴(kuò)增得到的總長(zhǎng)為443bp的序列，其中第106?112bp為堿基ACTAAGA，第201?210bp為堿基CCTATCTATA。利用該DNA條形碼將大大有利于藥用植物直緣烏頭的快速鑒定。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子鑒定技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于大數(shù)據(jù)的直緣烏頭DNA條形碼，及利用該DNA條形碼鑒定直緣烏頭的方法。

背景技術(shù)

直緣烏頭(Aconitum transsectum Diels)，又名大草烏、草烏、小黑牛，為毛莨科烏頭屬多年生草本植物，分布于我國(guó)云南西北部麗江玉龍山，民間常用于治療跌打損傷、風(fēng)濕骨痛等癥。直緣烏頭的塊根是已知藥用草烏中最大的，因富含草烏甲素(Bulleyaconitine A)近年來被大量栽培。草烏甲素為二萜生物堿，是目前臨床療效最好，有效劑量和中毒劑量差異最大的作用于外周神經(jīng)系統(tǒng)的非成癮性鎮(zhèn)痛藥物，以草烏甲素為原料的片劑、膠囊劑等劑型作為鎮(zhèn)痛藥可作為長(zhǎng)期用藥。然而，與烏頭屬的其他植物一樣，直緣烏頭的塊根也有大毒。烏頭屬植物在我國(guó)有200余種，在云南省分布的就有70余種，依靠傳統(tǒng)的形態(tài)分類或顯微鑒定的方法在烏頭屬藥用物種的鑒別上存在局限性。為便于規(guī)范用藥，如何快速準(zhǔn)確的鑒定直緣烏頭這一問題急需解決。

DNA條形碼技術(shù)(DNA Barcoding)是通過對(duì)一個(gè)或多個(gè)標(biāo)準(zhǔn)目的基因的DNA序列進(jìn)行分析，從而快速、準(zhǔn)確地進(jìn)行物種鑒定的技術(shù)。近幾年來，DNA條形碼技術(shù)已經(jīng)被證明是一個(gè)行之有效的生物鑒定手段，不僅可對(duì)傳統(tǒng)鑒定方法作強(qiáng)有力的補(bǔ)充，而且因?yàn)槠涓陀^、準(zhǔn)確，突破以往對(duì)經(jīng)驗(yàn)的過渡依賴，能幫助鑒定物種。不同的基因片段對(duì)不同物種的鑒定能力存在很大差異，根據(jù)本發(fā)明人的前期研究和已有的研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)，基因片段matK，trnH-psbA和ITS對(duì)烏頭屬物種有一定的鑒別能力，但仍無法有效的將直緣烏頭與其他常用的烏頭屬藥用植物進(jìn)行區(qū)分。本發(fā)明將在對(duì)烏頭屬藥用植物同一物種進(jìn)行多地方廣泛采樣的基礎(chǔ)上，先構(gòu)建不同物種的DNA條形碼大數(shù)據(jù)庫，然后從中獲得直緣烏頭的特有信息位點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)快速鑒定。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種基于大數(shù)據(jù)的直緣烏頭DNA條形碼，及利用該DNA條形碼鑒定直緣烏頭的方法，實(shí)現(xiàn)快速鑒定，提高鑒定結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確率。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明提供一種基于大數(shù)據(jù)的直緣烏頭DNA條形碼，所述DNA條形碼為由引物序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2擴(kuò)增得到的總長(zhǎng)為443bp的序列，其中第106-112bp為堿基ACTAAGA，第201-210bp為堿基CCTATCTATA。

優(yōu)選的，所述DNA條形碼的序列如SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明還提供一種基于大數(shù)據(jù)DNA條形碼的直緣烏頭鑒定方法，包括以下步驟：

(1)提取待測(cè)樣本DNA；

(2)利用DNA條形碼引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到443bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，所述DNA條形碼引物序列為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2；

(3)對(duì)所述擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，按照下列特異性位點(diǎn)進(jìn)行直緣烏頭物種鑒別的序列特征比對(duì)：第106-112bp為堿基ACTAAGA，第201-210bp為堿基CCTATCTATA；

若擴(kuò)增產(chǎn)物符合上述條件，則該待測(cè)樣本為直緣烏頭。