[發明專利]一種用于檢測目的基因低頻突變的引物及試劑盒

在審

• 申請號: 201710976796.8
• 申請日: 2017-10-19
• 公開（公告）號: CN107604067A
• 公開（公告）日: 2018-01-19
• 發明（設計）人: 鄭喬松;師曉;陳敏;張凱華;國曉玲
• 申請（專利權）人: 北京泛生子基因科技有限公司;北京泛生子醫學檢驗實驗室有限公司;重慶今創泛生醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢,白艷

技術領域

本發明屬于生物技術領域，尤其涉及一種用于檢測目的基因低頻突變的引物及試劑盒。

背景技術

腫瘤具有高度異質性，其中的致病突變可能以極低的比例存在，腫瘤患者的血液、尿液和腦脊液中的cfDNA中的目的基因的突變位點或突變區域的突變頻率會影響將來腫瘤用藥或者腫瘤發展方向的判斷。因此，檢測腫瘤患者的血液、尿液和腦脊液中的cfDNA中的目的基因的突變位點或突變區域的突變頻率成為研究重點，這就需要對突變位點或者突變區域進行測序，檢測突變頻率。

目前二代測序最準的Hiseq測序本身的錯誤率就在0.2％上下，除此之外，當前的DNA聚合酶的擴增錯誤率也在10^-7-10^-5之間，因此，如何能夠在測序結果中排除擴增錯誤和測序錯誤，直接反應出樣本中原始模板分子的低頻變異情況就成為了問題的關鍵。

腫瘤患者的血液、尿液和腦脊液中的cfDNA的含量很少，這對低頻突變的檢測來說是個難題。當前市場上主要有三種低頻突變的檢測方式：數字PCR、下一代測序(next-generation sequencing，NGS)和突變擴增系統(amplification refractory mutation system，ARMS)PCR。NGS具有高通量、低成本、快速、操作簡便等優勢，是目前國內最熱門的低頻突變檢測技術。在NGS過程中，構建基因文庫是整個測序進程中第一個步驟，也是最為關鍵步驟，基因文庫的質量直接影響后續的測序工作。但是，市場上常規的建庫方法均存在成本高、檢測周期長、流程復雜、文庫易被污染以及對檢測人員要求高等缺陷，不適用于大量樣本的測序建庫。

發明內容

本發明的一個目的是提供用于檢測待測樣本目的基因待檢區域的突變情況的成套引物。

本發明提供的成套引物包括Barcode引物F1、上游引物F2、下游外引物R1、下游內引物R2；

所述Barcode引物F1依次由測序接頭1、用于區分不同樣本的barcode序列和通用序列1組成；

所述上游引物F2依次由通用序列1、分子標簽、特定堿基序列和上游特異性引物序列組成；

所述下游外引物R1依次由測序接頭2和通用序列2組成；

所述下游內引物R2依次由通用序列2和下游特異性引物序列組成；

所述測序接頭1和所述測序接頭2為根據不同測序平臺選擇對應的測序接頭；

所述barcode序列均為長度為8-12nt、無連續堿基，且GC含量為40-60％的核苷酸；

所述通用序列1和所述通用序列2的長度均為16-25nt，且無連續堿基，GC含量為35-65％，無明顯二級結構；

所述特定堿基序列為GAT；

所述上游特異性引物序列和所述下游特異性引物序列是擴增所述目的基因待檢區域的引物；

所述分子標簽為10-12位隨機堿基。

上述成套引物中，

所述測序平臺為Illumina平臺，所述測序接頭1為I5，所述測序接頭2為I7；

或所述測序平臺為Ion Torrent平臺，所述測序接頭1為A，所述測序接頭2為P。

上述成套引物中，

所述Barcode引物F1、所述上游引物F2、所述下游外引物R1和所述下游內引物R2的摩爾比為6:(10-6):(1-3):(1-3)。

上述成套引物中，

所述突變為低頻突變，具體為突變頻率最低至0.1％。

上述成套引物中，

所述待測樣本為腫瘤患者的離體血液分離的cfDNA、腫瘤患者的離體尿液分離的cfDNA、腫瘤患者的離體腦脊液分離的cfDNA或腫瘤患者的離體腫瘤組織提取的基因組DNA。

上述成套引物中，

所述通用序列1的核苷酸序列為序列1；

所述通用序列2的核苷酸序列為序列2；

所述測序接頭1的核苷酸序列為序列3；

所述測序接頭2的核苷酸序列為序列4；

所述用于區分不同樣本的barcode序列分別為序列5-序列14；

所述待測基因為NRAS，對應的上游特異性引物序列和下游特異性引物序列分別為序列15和序列16或序列17或序列18；

所述待測基因為ALK，對應的上游特異性引物序列和下游特異性引物序列分別為序列19和序列20或序列21和序列22或序列23和序列24或序列25和序列26或序列27和序列28或序列29和序列30或序列31和序列32；