[發明專利]一種用于檢測目的基因低頻突變的引物及試劑盒

在審

• 申請號: 201710976796.8
• 申請日: 2017-10-19
• 公開（公告）號: CN107604067A
• 公開（公告）日: 2018-01-19
• 發明（設計）人: 鄭喬松;師曉;陳敏;張凱華;國曉玲
• 申請（專利權）人: 北京泛生子基因科技有限公司;北京泛生子醫學檢驗實驗室有限公司;重慶今創泛生醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢,白艷

1.用于檢測待測樣本目的基因待檢區域的突變情況成套引物，包括Barcode引物F1、上游引物F2、下游外引物R1、下游內引物R2；

所述Barcode引物F1依次由測序接頭1、用于區分不同樣本的barcode序列和通用序列1組成；

所述上游引物F2依次由通用序列1、分子標簽、特定堿基序列和上游特異性引物序列組成；

所述下游外引物R1依次由測序接頭2和通用序列2組成；

所述下游內引物R2依次由通用序列2和下游特異性引物序列組成；

所述測序接頭1和所述測序接頭2為根據不同測序平臺選擇對應的測序接頭；

所述barcode序列均為長度為8-12nt、無連續堿基，且GC含量為40-60％的核苷酸；

所述通用序列1和所述通用序列2的長度均為16-25nt，且無連續堿基，GC含量為35-65％，無明顯二級結構；

所述特定堿基序列為GAT；

所述上游特異性引物序列和所述下游特異性引物序列是擴增所述目的基因待檢區域的引物；

所述分子標簽為10-12位隨機堿基。

2.根據權利要求1所述的成套引物，其特征在于：

所述測序平臺為Illumina平臺，所述測序接頭1為I5，所述測序接頭2為I7；

或所述測序平臺為Ion Torrent平臺，所述測序接頭1為A，所述測序接頭2為P。

3.根據權利要求1或2所述的成套引物，其特征在于：

所述Barcode引物F1、所述上游引物F2、所述下游外引物R1和所述下游內引物R2的摩爾比為6:(10-6):(1-3):(1-3)。

4.根據權利要求1-3中任一所述的成套引物，其特征在于：所述突變為低頻突變。

5.根據權利要求1-4中任一所述的成套引物，其特征在于：所述待測樣本為腫瘤患者的離體血液分離的cfDNA、腫瘤患者的離體尿液分離的cfDNA、腫瘤患者的離體腦脊液分離的cfDNA或腫瘤患者的離體腫瘤組織提取的基因組DNA。

6.根據權利要求1-5中任一所述的成套引物，其特征在于：

所述通用序列1的核苷酸序列為序列1；

所述通用序列2的核苷酸序列為序列2；

所述測序接頭1的核苷酸序列為序列3；

所述測序接頭2的核苷酸序列為序列4；

所述用于區分不同樣本的barcode序列分別為序列5-序列14；

所述待測基因為NRAS，對應的上游特異性引物序列和下游特異性引物序列分別為序列15和序列15或序列17或序列18；

所述待測基因為ALK，對應的上游特異性引物序列和下游特異性引物序列分別為序列19和序列20或序列21和序列22或序列23和序列24或序列25和序列26或序列27和序列28或序列29和序列30或序列31和序列32；

所述待測基因為PIK3CA，對應的上游特異性引物序列和下游特異性引物序列分別為序列33和序列34或序列35或序列36；

所述待測基因為ROS，對應的上游特異性引物序列和下游特異性引物序列分別為序列37和序列38；

所述待測基因為EGFR，對應的上游特異性引物序列和下游特異性引物序列分別為序列39和序列40或序列41和序列42或序列43和序列44或序列45和序列46或序列47和序列48；

所述待測基因為MET，對應的上游特異性引物序列和下游特異性引物序列分別為序列49和序列50或序列51和序列52或序列53和序列54或序列55和序列56；

所述待測基因為BRAF，對應的上游特異性引物序列和下游特異性引物序列分別為序列57和序列58或序列59和序列60；

所述待測基因為KRAS，對應的上游特異性引物序列和下游特異性引物序列分別為序列61和序列62或序列63和序列64；

所述待測基因為TP53，對應的上游特異性引物序列和下游特異性引物序列分別為序列65和序列66或序列67和序列68或序列69和序列70或序列71和序列72或序列73和序列74或序列75和序列76；

所述待測基因為ERBB2，對應的上游特異性引物序列和下游特異性引物序列分別為序列77和序列78。

7.用于檢測待測樣本目的基因待檢區域的突變情況的試劑，包括權利要求1-6中任一所述的成套引物和含有PCR擴增緩沖液和DNA聚合酶的體系。