[發(fā)明專利]一種檢測(cè)環(huán)境中真菌毒素的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710967376.3
• 申請(qǐng)日: 2017-10-17
• 公開（公告）號(hào): CN107515295B
• 公開（公告）日: 2020-03-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃大偉;秦品珠;徐子昊;馬倩慧;邴永鑫;洪偉;崔愷;鄭文麗;張政科;于曉巍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 環(huán)境保護(hù)部華南環(huán)境科學(xué)研究所
• 主分類號(hào): G01N33/53
• 分類號(hào): G01N33/53
• 代理公司: 南京申云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32274
• 代理人: 邱興天

本發(fā)明公開了一種檢測(cè)環(huán)境中真菌毒素的方法，包括：熒光染料標(biāo)記aptamer識(shí)別探針，aptamer與待測(cè)真菌毒素配體特異結(jié)合，制備納米顆粒修飾的捕獲探針，未反應(yīng)的aptamer探針與磁性納米顆粒修飾的探針發(fā)生雜交反應(yīng)；磁性分離，測(cè)定上清液中熒光信號(hào)強(qiáng)弱判斷與aptamer結(jié)合的真菌毒素的量；對(duì)磁性分離后的雜交體，進(jìn)行解鏈，水洗，再磁性分離，實(shí)現(xiàn)磁性納米顆粒標(biāo)記探針的再生。本發(fā)明的方法，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程時(shí)間短，操作步驟簡(jiǎn)單快捷，具體反應(yīng)步驟沒有用到大型儀器，較易于推廣?？芍貜?fù)利用，節(jié)約資源，同時(shí)省去制備捕獲探針的步驟，使得檢測(cè)更加快捷簡(jiǎn)單，檢測(cè)限低，特異性好，具有很好的實(shí)用性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及真菌毒素檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)環(huán)境中真菌毒素的方法。

背景技術(shù)

真菌毒素是特定的真菌或者霉菌產(chǎn)生的毒性次級(jí)代謝產(chǎn)物，可致癌、致畸、致突變，也可造成中毒性腎損害、肝細(xì)胞毒性、免疫抑制等，給人類的健康造成極大的威脅。目前真菌毒素的分析方法主要有薄層層析法(TLC)、氣相色譜法(GC)、液相色譜法(LC)、液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)、氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)、高效液相色譜-熒光檢測(cè)發(fā)(HPLC-FLD)、毛細(xì)管電泳法(CE)、免疫分析法等。色譜分析法靈敏度高，但是操作復(fù)雜、儀器昂貴，且需要專業(yè)人員實(shí)施，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的需求。用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的方法主要為免疫分析法包括：膠體金快捷型(直接法)、膠體金精準(zhǔn)型(萃取復(fù)溶法)及酶聯(lián)免疫試劑盒Elisa，前兩者只能定性分析，酶聯(lián)免疫試劑盒操作相對(duì)復(fù)雜，檢測(cè)樣品范圍較窄，不適合基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。而且基于免疫技術(shù)的方法抗體制備成本高，容易受到pH值、溫度等環(huán)境因素的影響，也限制了其發(fā)展和應(yīng)用。

分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)的發(fā)展，使人們對(duì)真菌霉素的檢測(cè)也從生化、免疫方法轉(zhuǎn)向基因水平的檢測(cè)。核酸適配體(aptamer)是近幾年來(lái)通過(guò)體外篩選技術(shù)(指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，從核酸分子文庫(kù)中得到的寡核苷酸片段。Aptamer與各種配體的結(jié)合是基于單鏈核酸結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)象的多樣性，它可通過(guò)鏈內(nèi)某些互補(bǔ)堿基間的配對(duì)以及靜電作用、氫鍵作用等自身發(fā)生適應(yīng)性折疊，形成一些穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)：如發(fā)卡(hairpin)、假結(jié)(pseudoknot)、凸環(huán)(stem loop)、G-四分體(G-quartet)等。Aptamer可以通過(guò)范德華力、氫鍵作用、靜電作用和形狀匹配等各種相互作用與配體產(chǎn)生高特異性的結(jié)合力。Apatamer比蛋白質(zhì)體積小、合成容易、穩(wěn)定性更好，且擁有與抗原-抗體反應(yīng)相匹敵的靈敏度，成為近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究者的熱點(diǎn)，已在食品安全檢測(cè)、環(huán)境檢測(cè)、新藥研發(fā)、臨床診斷及毒理研究等領(lǐng)域展示了良好的應(yīng)用前景?；赼patmer技術(shù)的真菌毒素檢測(cè)也有了應(yīng)用突破，目前研究者已經(jīng)成功篩選了赭曲霉素A(OTA)、黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、伏馬菌素B1、玉米赤霉烯酮等真菌毒素的適配體序列。利用aptamer與配體的適應(yīng)性識(shí)別的特性可以應(yīng)用于真菌毒素檢測(cè)前的前處理，該凈化方法可有效地避免使用大量有機(jī)溶劑、排除其它物質(zhì)干擾，再生時(shí)間短可以多次反復(fù)使用?；赼ptamer技術(shù)和各種新型材料相結(jié)合的光化學(xué)、電化學(xué)真菌毒素的分析技術(shù)不斷出現(xiàn)：如基于“Signal-off”、“Signal-on”模式的傳感器用來(lái)檢測(cè)食品中的真菌毒素，但是電化學(xué)傳感器容易受到電流、電壓信號(hào)的影響。

如何采用更好的方法或較為簡(jiǎn)單的儀器進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)是目前研究的熱門課題，熒光標(biāo)記法是常用的方法，由于其背景低、檢測(cè)靈敏度高，使基于該檢測(cè)方法的aptamer也成為分子識(shí)別的研究重點(diǎn)。出現(xiàn)了基于適配體結(jié)構(gòu)開關(guān)的生物熒光傳感器、免疫標(biāo)記分子信標(biāo)熒光生物傳感器等。