[發明專利]一種蝙蝠蛾擬青霉菌絲粉中腺苷含量的快速檢測方法

在審

• 申請號: 201710964748.7
• 申請日: 2017-10-17
• 公開（公告）號: CN107817303A
• 公開（公告）日: 2018-03-20
• 發明（設計）人: 葉松;郭晴;王祥河;王婷;曹琳琳
• 申請（專利權）人: 天津實發中科百奧工業生物技術有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 天津盛理知識產權代理有限公司12209
• 代理人: 劉玲

技術領域

本發明屬于保健食品活性成分檢測領域，涉及蝙蝠蛾擬青霉菌絲粉活性成分的檢測，特別涉及一種蝙蝠蛾擬青霉菌絲粉中腺苷含量的快速檢測方法。

背景技術

冬蟲夏草為麥角菌科的藥用真菌，含有豐富的生理活性物質，具有獨特的藥用價值和廣泛的藥理作用，是中國特產的名貴中藥材。近年來，人們從冬蟲夏草真菌菌絲中分離出多種生物活性物質，主要有腺苷、蟲草多糖、D-甘露醇、甾醇類等成分，這些主要成分具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力等多種生理功能。

目前，冬蟲夏草的人工培育技術已較為成熟，根據培養方式的不同可分為固體栽培和液體發酵兩種。與固體栽培相比，液體發酵具有周期短、工藝簡單、不易污染、菌絲體產量大等優點。中國科學院微生物研究所和南開大學權威部門通過對天然冬蟲夏草液體發酵方法培養得到蝙蝠蛾擬青霉蝙蝠蛾擬青霉菌絲體。研究顯示蝙蝠蛾擬青霉菌絲粉中的腺苷等有效成分的含量與野生冬蟲夏草相當，具有廣闊的應用前景。

腺苷又稱腺嘌呤核苷，是人體循環疾病的藥物。因為腺苷具有舒張血管、降低血壓、減慢心率、抑制血小板等多種生理活性。腺苷是合成三磷酸腺苷(ATP)的主要原料，ATP已廣泛應用于治療心腦不全、腦動脈硬化及肌肉萎縮等癥。腺苷已成為蝙蝠蛾擬青霉菌絲體發酵培養的重要指示性物質，因此，快速、有效的檢測方法對于指導蝙蝠蛾擬青霉菌絲體發酵工藝研究具有重要的意義。

按照《保健食品檢驗與評價技術規范》(2003版)中保健食品中腺苷的測定方法或《中國藥典》(2010版)中金水寶膠囊中腺苷含量的測定方法是目前國內絕大多數工廠腺苷檢測使用的方法。上述兩種方法均采用直接超聲的單一方式對腺苷進行提取，存在腺苷提取效率低的問題。并且，前者由于提取液為60％乙醇，極性較小，而蝙蝠蛾擬青霉菌絲粉中腺苷的極性相對較大，存在有效成分不能充分提取、腺苷含量測定不準確等問題，后者在進行液相色譜檢測時，采用含2％四氫呋喃的磷酸鹽緩沖溶液(0.066mol/L磷酸二氫鉀：0.066mol/L磷酸氫二鈉＝2：3)作為流動相，存在操作繁瑣，流動相較為復雜，對儀器損耗大等問題，因此不能滿足產品快速檢驗的要求。

通過對公開專利文獻的檢索，并未發現與本專利申請相同的公開專利文獻，本專利申請涉及的蝙蝠蛾擬青霉，是從天然的冬蟲夏草中分離得到，經中國科學院微生物研究所鑒定，確定為蝙蝠蛾擬青霉。將蝙蝠蛾擬青霉通過液體發酵培養，經過濾、烘干后，得到本發明所用的菌絲體干粉。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術的不足，提供一種檢測快速、準確，有效成分提取效率高且流動相損耗小的蝙蝠蛾擬青霉菌絲粉中腺苷含量的快速檢測方法。

本發明解決其技術問題是通過以下技術方案實現的：

一種蝙蝠蛾擬青霉菌絲粉中腺苷含量的快速檢測方法，其特征在于：該方法包括如下步驟：

1)腺苷標準溶液配制：

稱量腺苷標準品，用腺苷提取液溶解并定容，形成腺苷母液，用該腺苷母液配制成濃度分別為10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的腺苷標準溶液，備用；

2)樣品溶液配制：

稱取蝙蝠蛾擬青霉菌絲粉樣品0.5g，加入5mL腺苷提取液溶解混勻，加入50mg石英砂并研磨至糊狀，冷卻后轉移至25mL比色管中并加腺苷提取液定容，用超聲波振蕩器超聲振蕩混合，在-20℃環境下冷凍再融化，反復凍融操作兩次后冷卻并轉移至離心機中離心處理，取上清液經0.45um濾膜過濾，制成樣品溶液，備用；

3)高效液相色譜法檢測分析：

將上述腺苷標準溶液與樣品溶液分別注入到液相色譜儀中進行液相色譜分析，以腺苷標準溶液的峰面積A為縱坐標，腺苷標準溶液濃度C為橫坐標得到腺苷標準曲線A＝69117C+348.01，將相同時間內樣品溶液的峰面積A’帶入到腺苷標準曲線中，得到樣品溶液中的腺苷含量C’，再根據樣品溶液中腺苷含量計算得出蝙蝠蛾擬青霉菌絲粉樣品中的腺苷質量分數。

而且，步驟3)中所述腺苷質量分數w采用如下公式進行計算：

w＝(0.25C’/m)*100％

其中：C’為樣品溶液中的腺苷含量，單位為mg/mL；

m為蝙蝠蛾擬青霉菌絲粉樣品的質量，單位為g。

而且，所述的液相色譜條件為：

色譜柱：Waters Symmetry C185μm 4.6×150mm；

流動相：有機相為甲醇，水相為超純水；

流速：1mL/min；

柱溫：25℃；