[發(fā)明專利]特異性增強CRISPR-CAS系統(tǒng)基因編輯效率的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710948764.7
• 申請日: 2017-10-12
• 公開（公告）號: CN107474129B
• 公開（公告）日: 2018-10-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 韓之波
• 申請（專利權(quán)）人: 江西漢氏聯(lián)合干細(xì)胞科技有限公司
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/113;C12N15/90
• 代理公司: 深圳市蘭鋒知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44419
• 代理人: 曹明蘭

本發(fā)明提供了一些新的增效蛋白CREnhancer1.0，能夠顯著提高細(xì)胞內(nèi)CRISPR/Cas9基因編輯效率，為提高細(xì)胞中基因編輯效率提供了新的途徑；還提供了一種更高效的基因組編輯系統(tǒng)，當(dāng)本發(fā)明所述增效蛋白在與CRISPR/Cas9共同使用時，可以顯著提升CRISPR/Cas9的基因組編輯的效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明提供一種提高CRISPR-cas系統(tǒng)基因編輯效率的方法，特別是涉及一種新的能夠顯著提高同源重組概率的增效因子，將所述增效因子與CRISPR-cas系統(tǒng)結(jié)合可顯著提高基因組編輯效率。

背景技術(shù)

CRISPR簇是一個廣泛存在于細(xì)菌和古生菌基因組中的特殊DNA重復(fù)序列家族，其序列由一個前導(dǎo)區(qū)(Leader)、多個短而高度保守的重復(fù)序列區(qū)(Repeat)和多個間隔區(qū)(Spacer)組成。前導(dǎo)區(qū)一般位于CRISPR簇上游，是富含AT長度為300～500bp的區(qū)域，被認(rèn)為可能是CRISPR簇的啟動子序列。重復(fù)序列區(qū)長度為21～48bp，含有回文序列，可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)。重復(fù)序列之間被長度為26～72bp的間隔區(qū)隔開。Spacer區(qū)域由俘獲的外源DNA組成，類似免疫記憶，當(dāng)含有同樣序列的外源DNA入侵時，可被細(xì)菌機體識別，并進行剪切使之表達(dá)沉默，達(dá)到保護自身安全的目的。

通過對CRISPR簇的側(cè)翼序列分析發(fā)現(xiàn)，在其附近存在一個多態(tài)性家族基因。該家族編碼的蛋白質(zhì)均含有可與核酸發(fā)生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且與CRISPR區(qū)域共同發(fā)揮作用，因此被命名為CRISPR關(guān)聯(lián)基因(CRISPRassociated)，縮寫為Cas。目前發(fā)現(xiàn)的Cas包括Cas1～Cas10等多種類型。Cas基因與CRISPR共同進化，共同構(gòu)成一個高度保守的系統(tǒng)。

當(dāng)細(xì)菌抵御噬菌體等外源DNA入侵時，在前導(dǎo)區(qū)的調(diào)控下，CRISPR被轉(zhuǎn)錄為長的RNA前體(Pre RISPR RNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重復(fù)序列和間隔區(qū)的成熟crRNA，最終識別并結(jié)合到與其互補的外源DNA序列上發(fā)揮剪切作用。

目前發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)有三種不同類型即I型、II型和III型，它們存在于大約40％已測序的真細(xì)菌和90％已測序的古細(xì)菌中。其中II型的組成較為簡單，以Cas9蛋白以及向?qū)NA(gRNA)為核心組成，也是目前研究中最深入的類型。

在II型系統(tǒng)中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9單獨參與。Cas9含有在氨基末端的RuvC和蛋白質(zhì)中部的HNH2個獨特的活性位點，在crRNA成熟和雙鏈DNA剪切中發(fā)揮作用。此外，pre-crRNA轉(zhuǎn)錄的同時，與其重復(fù)序列互補的反式激活crRNA(Trans-activatingcrRNA，tracrRNA)也轉(zhuǎn)錄出來，并且激發(fā)Cas9和雙鏈RNA特異性RNase III核酸酶對pre-crRNA進行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9組成復(fù)合體，識別并結(jié)合于crRNA互補的序列，然后解開DNA雙鏈，形成R-loop，使crRNA與互補鏈雜交，另一條鏈保持游離的單鏈狀態(tài)，然后由Cas9中的HNH活性位點剪切crRNA的互補DNA鏈，RuvC活性位點剪切非互補鏈，最終引入DNA雙鏈斷裂(DSB)。CRISPR/Cas9的剪切位點位于crRNA互補序列下游鄰近的PAM區(qū)(Protospacer Adjacent Motif)的5'-GG-N18-NGG-3'特征區(qū)域中的NGG位點，而這種特征的序列在每128bp的隨機DNA序列中就重復(fù)出現(xiàn)一次。研究結(jié)果表明，Cas9還可以剪切線性和超螺旋的質(zhì)粒，其剪切效率堪比限制性內(nèi)切酶。