[發(fā)明專利]一種反硝化脫氮復合菌劑及其制備方法和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710947770.0
• 申請日: 2017-10-12
• 公開（公告）號: CN107488621B
• 公開（公告）日: 2021-06-01
• 發(fā)明（設計）人: 楊革;劉勝格;車程川;鞏志金;劉金鋒;安笑遲
• 申請（專利權）人: 曲阜師范大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C02F3/34;C12R1/01;C12R1/025;C02F101/16
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 李桂存

1.一種反硝化脫氮復合菌劑，其特征在于，是由以下體積百分比的菌種制得的：副球菌25％、蒼白桿菌25％、無色桿菌50％；

所述的副球菌(Paracoccus sp.)購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所)，編號：CGMCC No.13607；

所述的蒼白桿菌(ochrobactrum sp.)購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所)，編號：CGMCC No.8839；

所述的無色桿菌(Achromobacter sp.)購自中國普通微生物菌種保藏管理中心(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學院微生物研究所)，編號：CGMCC No.7139。

2.根據權利要求1所述的反硝化脫氮復合菌劑，其特征在于，所述副球菌的活菌數為1×10⁷-1×10⁹CFU/g；所述蒼白桿菌的活菌數為1×10⁷-1×10¹⁰CFU/g；所述無色桿菌的活菌數為1×10⁵-1×10⁹CFU/g。

3.一種權利要求1或2所述的反硝化脫氮復合菌劑的制備方法，其特征在于，是由以下步驟制備得到的：

1)分別取斜面保種的副球菌、蒼白桿菌和無色桿菌各兩環(huán)，分別接種于固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25-35℃，培養(yǎng)時間1-3d，分別得副球菌、蒼白桿菌和無色桿菌的活化菌種；

2)將富集培養(yǎng)基分裝至250mL三角瓶中，50-100mL/瓶；將副球菌、蒼白桿菌和無色桿菌的活化菌種分別于斜面上接取兩環(huán)于富集培養(yǎng)基中進行搖床振蕩培養(yǎng)，搖床振蕩培養(yǎng)轉速120-180r/min，搖床振蕩培養(yǎng)溫度25-35℃，搖床振蕩培養(yǎng)時間1-3d，分別得副球菌、蒼白桿菌和無色桿菌的種子液；

3)將副球菌、蒼白桿菌和無色桿菌的種子液按照2-10％的接種量分別接種于液體培養(yǎng)基進行搖床振蕩培養(yǎng)，搖床振蕩培養(yǎng)轉速120-180r/min，搖床振蕩培養(yǎng)溫度25-35℃，當副球菌培養(yǎng)液中活菌數達到1×10⁷-1×10⁹CFU/g、蒼白桿菌培養(yǎng)液中活菌數達到1×10⁷-1×10¹⁰CFU/g和無色桿菌培養(yǎng)液中活菌數達到1×10⁵-1×10⁹CFU/g，分別停止培養(yǎng)；

4)將步驟3)得到的菌液按照體積百分比：副球菌20-30％、蒼白干菌30-40％，和無色桿菌40-60％，混合，得復合菌液；

5)取50-100mL復合菌液，6000r/min離心去除上清液，得濕菌體；將濕菌體重懸于50-100mL生理鹽水中，離心，重復操作2-3次，得復合菌懸液；

所述生理鹽水的濃度為0.9％；

6)將復合菌懸液和保護劑混合均勻，噴霧干燥，噴霧干燥進風溫度120-180℃，進料流量12-17ml/min，得反硝化脫氮復合菌劑。

4.根據權利要求3所述的反硝化脫氮復合菌劑的制備方法，其特征在于，所述固體培養(yǎng)基為牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，具體組成：牛肉膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，瓊脂15-20g/L，其余為水。

5.根據權利要求3所述的反硝化脫氮復合菌劑的制備方法，其特征在于，所述富集培養(yǎng)基的組成：KNO₃ 2-5g/L，蛋白胨5-10g/L，牛肉膏5-10g/L，其余為水。

6.根據權利要求3所述的反硝化脫氮復合菌劑的制備方法，其特征在于，所述液體培養(yǎng)基的組成：乙酸鈉1-20g/L，KNO₃ 0.1-5g/L，K₂HPO₄·3H₂O 0.1-2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.1-1g/L，其余為水。