[發(fā)明專利]木聚糖酶基因、重組表達(dá)載體、重組表達(dá)菌株、木聚糖酶及其制備方法、及飼料的制備方法

有效

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• 申請日: 2017-09-30
• 公開（公告）號: CN107699584B
• 公開（公告）日: 2020-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊江科;馬騰飛
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢輕工大學(xué)
• 主分類號: C12N15/56
• 分類號: C12N15/56;C12N9/24;C12N15/81;C12N15/66;C12N1/19;A23K20/189;A23K10/14;C12R1/84
• 代理公司: 深圳市世紀(jì)恒程知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 44287
• 代理人: 胡海國

本發(fā)明公開一種木聚糖酶基因、重組表達(dá)載體、重組表達(dá)菌株、木聚糖酶及其制備方法、及飼料的制備方法，其中，所述木聚糖酶基因Xynsyn2用于編碼木聚糖酶，所述木聚糖酶基因Xynsyn2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本發(fā)明提供的木聚糖酶基因Xynsyn2，采用了畢赤酵母中的高頻密碼子替換原有的低頻密碼子，降低了mRNA的自由能及其mRNA二級結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，消除了基因中富含AT或GC的區(qū)域以及木聚糖酶中的蛋白酶作用位點(diǎn)，從而顯著提高了人工合成的木聚糖酶基因Xynsyn2在畢赤酵母細(xì)胞中的表達(dá)量，提高了木聚糖酶的酶活力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種木聚糖酶基因、重組表達(dá)載體、重組表達(dá)菌株、木聚糖酶及其制備方法、及飼料的制備方法。

背景技術(shù)

現(xiàn)有的飼料一般以玉米、小麥、麩皮或稻谷等作為主要原料，其中含有較多的非淀粉性多糖(包括阿拉伯木聚糖、葡聚糖、果膠以及纖維素等)，但是由于非反芻類動物體內(nèi)缺少降解纖維素的酶，使其無法消化半纖維素而容易形成糜狀積食，影響動物腸道微生物的種群類型，從而影響對飼料的吸收。在飼料中添加合適的木聚糖酶可以破碎植物細(xì)胞壁并水解半纖維素，從而達(dá)到降低食糜粘度的目的，提高飼料的利用率。

在工業(yè)生產(chǎn)中制備飼料的過程中，其工藝溫度較高，因此需要木聚糖酶在高溫條件下仍具有活性。但是現(xiàn)有的木聚糖酶的制備方法，一種是通過PCR 技術(shù)從相關(guān)產(chǎn)木聚糖酶的微生物中擴(kuò)增出木聚糖基因，連接到表達(dá)載體中，再導(dǎo)入相關(guān)表達(dá)宿主來表達(dá)木聚糖酶，制備出來的木聚糖酶的最適溫度比較低、最適pH偏中性且蛋白的表達(dá)量小，工業(yè)應(yīng)用限制較大；另一種是從自然界產(chǎn)木聚糖酶的微生物中篩選菌株，然后對菌株進(jìn)行改良或者對發(fā)酵工藝盡心優(yōu)化，制備出來的木聚糖酶的酶活和表達(dá)量均不高、且最適溫度較低，在工業(yè)生產(chǎn)中容易失活。

畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)是目前廣泛使用的真核生物表達(dá)系統(tǒng)，具有生物安全性好、遺傳元件穩(wěn)定、高密度發(fā)酵工藝成熟、表達(dá)水平高以及目的蛋白分離純化簡便等優(yōu)點(diǎn)，是異源蛋白中工業(yè)化生產(chǎn)的理想宿主。然而，由于受到畢赤酵母對異源基因密碼子使用偏好性、mRNA二級結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性、基因中富含A/T或G/C區(qū)段、蛋白酶切割位點(diǎn)以及基因在宿主中的豐度等因素影響，異源基因在畢赤酵母中難以獲得高效表達(dá)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的主要目的是提出一種木聚糖酶基因、重組表達(dá)載體、重組表達(dá)菌株、木聚糖酶及其制備方法、及飼料的制備方法，旨在提高木聚糖酶基因在木聚糖酶中的表達(dá)量。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出一種木聚糖酶基因Xynsyn2，用于編碼木聚糖酶，所述木聚糖酶基因Xynsyn2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本發(fā)明還提出一種木聚糖酶，所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO： 2所示。

本發(fā)明還提出一種重組表達(dá)載體，包括如上述的木聚糖酶基因Xynsyn2。

優(yōu)選地，所述木聚糖酶基因Xynsyn2的拷貝數(shù)為多個(gè)。

本發(fā)明還提出一種重組表達(dá)菌株，包括如上述的木聚糖酶基因Xynsyn2。

優(yōu)選地，所述重組表達(dá)菌株的宿主細(xì)胞為畢赤酵母。

本發(fā)明還提出一種如上述的重組表達(dá)載體的制備方法，包括如下步驟：

將合成的木聚糖酶基因Xynsyn2通過酶切位點(diǎn)EcoRⅠ連接到中間載體 pUC57，獲得pUC-Xynsyn2載體；

將pUC-Xynsyn2載體和pAO815載體分別用EcoRⅠ酶切，電泳、膠回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段；

將木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pAO815片段通過T4DNA連接酶連接，獲得pAO815-Xynsyn2重組表達(dá)載體。

本發(fā)明還提出一種如上述的重組表達(dá)菌株的制備方法，包括如下步驟：