[發(fā)明專(zhuān)利]一種制備高純河豚毒素的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710931458.2
• 申請(qǐng)日: 2017-10-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107880054A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 曾軍杰;張小軍;陳思;盧義博;李奇富
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江省海洋水產(chǎn)研究所;江蘇美正生物科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07D491/22
• 分類(lèi)號(hào): C07D491/22;A61K31/529;A61P25/30;A61P25/36;A61P25/04;A61P25/20;A61P23/02;A61P9/12;A61P9/00
• 代理公司: 杭州杭誠(chéng)專(zhuān)利事務(wù)所有限公司33109
• 代理人: 尉偉敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種化學(xué)物質(zhì)提取領(lǐng)域，尤其涉及一種以河豚魚(yú)內(nèi)臟為原料規(guī)?；⒏咝У靥崛∩a(chǎn)高純河豚毒素的方法。其產(chǎn)品可用于戒毒、鎮(zhèn)痛及降壓藥物制劑。

背景技術(shù)

河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一種由河豚魚(yú)內(nèi)臟提取的低分子量生物堿類(lèi)物質(zhì)。由于其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)使其成為細(xì)胞鈉離子通道專(zhuān)一阻斷劑。因此其在生物學(xué)研究領(lǐng)域作為生物試劑有著不可替代的位置。河豚毒素在醫(yī)學(xué)臨床上所顯示的藥理學(xué)作用，早在上世紀(jì)30年代就已有用于臨床介斷生物堿類(lèi)成癮性病癥的報(bào)道。在鎮(zhèn)痛治療方面也不斷有報(bào)道推出。因此，其無(wú)論在生物學(xué)研究領(lǐng)域還是在醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用方面，都顯示了十分重要的地位。

TTX是典型的鈉離子通道阻斷劑，它能選擇性與肌肉、神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞膜表面的鈉離子通道受體結(jié)合，阻斷電壓依賴(lài)性鈉離子通道，從而阻滯動(dòng)物電位，抑制神經(jīng)肌肉間興奮的傳導(dǎo)，導(dǎo)致與之相關(guān)的生理機(jī)能的障礙，主要造成肌肉和神經(jīng)的麻痹。構(gòu)效關(guān)系表明，TTX的活性基團(tuán)是1，2，3位的胍氨基和附近的C-4，C-9，C-10位的羥基，胍基在生理pH值下發(fā)生質(zhì)子化，形成正電活性區(qū)域與鈉離子通道受體蛋白的負(fù)電性羰基相互作用，從而阻礙離子進(jìn)入通道。鈉離子受體至少有6個(gè)特異性靶分子結(jié)合位點(diǎn)，TTX是與鈉通道受體部位I結(jié)合。TTX受體位于可興奮細(xì)胞膜外側(cè)、鈉通道外口附近，TTX與受體部位結(jié)合，阻礙鈉離子接近通道外口。研究表明，TTX特異性作用于鈉通道，對(duì)鉀、鈣通道和神經(jīng)肌肉的突觸及膽堿指酶無(wú)直接影響。此外，毒素能通過(guò)血腦屏障進(jìn)入中樞，對(duì)中樞產(chǎn)生明顯的抑制作用?？偟膩?lái)說(shuō)，TTX對(duì)呼吸和心血管的抑制是對(duì)中樞和外周的共同作用結(jié)果。

TTX由于在極微量的情況下就能阻斷細(xì)胞鈉離子的通道，而對(duì)鉀離子通道沒(méi)有影響，具有高度的轉(zhuǎn)移性，因此是十分有用的神經(jīng)生理研究用工具藥。

臨床醫(yī)學(xué)上已證明TTX是良好的鎮(zhèn)靜劑、解痙劑、鎮(zhèn)痛劑，特別對(duì)癌癥等惡性疼痛具有良好的鎮(zhèn)痛作用，與傳統(tǒng)的杜冷丁、嗎啡等鎮(zhèn)痛藥相比雖然響應(yīng)時(shí)間稍長(zhǎng)，但其鎮(zhèn)痛作用可達(dá)12-20小時(shí)，而且無(wú)成癮性。近來(lái)TTX在戒毒方面也顯示出良好的效果，一般戒毒者只需每日注射10μgTTX一針，5-7天為一個(gè)療程，毒癮即可得到控制，并可大大減輕一般戒毒中常常出現(xiàn)的戒毒綜合癥。

但河豚毒素注射液(水溶液)對(duì)溫度很敏感，容易受溫度的影響而發(fā)生降解，溫度越高，降解越快。一旦有效活性物質(zhì)河豚毒素含量低于其標(biāo)示量的90％或有關(guān)物質(zhì)的相對(duì)含量超過(guò)醫(yī)藥標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定限度(大于對(duì)照溶液主峰面積)就不符合臨床使用要求。試驗(yàn)證明，河豚毒素注射液(水針劑)在室溫下不穩(wěn)定，為了保證河豚毒素注射液的質(zhì)量，防止河豚毒素含量下降和有關(guān)物質(zhì)含量升高，必須將其置于4-8℃冰箱中保存。這就給河豚毒素的臨床適用帶來(lái)諸多困難和不便，相應(yīng)在貯存、運(yùn)輸、裝卸、批發(fā)、零售、醫(yī)院和應(yīng)用各個(gè)環(huán)節(jié)都得注意保持4-8℃低溫，否則溫度偏高可能影響臨床效果，對(duì)此，必須設(shè)法盡快予以解決，研制出安全穩(wěn)定，室溫下就能長(zhǎng)期貯存的可靠產(chǎn)品。為了解決上述問(wèn)題，一個(gè)簡(jiǎn)單的做法是將河豚毒素做成凍干制劑。一般在水溶液中不穩(wěn)定的生物活性物質(zhì)在凍干脫水后貯存期都可延長(zhǎng)，待臨床應(yīng)用時(shí)，加滅菌注射用水再生即可。但河豚毒素用于醫(yī)藥時(shí)，其每劑量的用量只有0.5-60μg，如此微量的河豚毒素在溶液中經(jīng)凍干脫水后形成不了所要求的固態(tài)殘留物，必需加入醫(yī)藥上能接受的賦形劑，才能提供微量河豚毒素得以附著的支架，在溶液凍干脫水后能形成固態(tài)物。

雖然目前提取、提純河豚毒素的方法繁多，但這些方法多多少少都存在著一定的缺陷，如產(chǎn)出純度高的高效液相法也存在這設(shè)備昂貴(高壓液相儀)的問(wèn)題，又例如浸漬分餾法，存在著效率低下、產(chǎn)品純度不高等問(wèn)題。

中國(guó)專(zhuān)利局于2008年6月18日公開(kāi)了一種河豚毒素制備方法的發(fā)明專(zhuān)利，授權(quán)公開(kāi)號(hào)為CN101891751B，該發(fā)明專(zhuān)利采用氨基酸作助溶劑，不僅能起到助溶劑的作用，增加河豚毒素在水中的溶解性，還能與河豚毒素形成高水溶性的鹽溶液，提供了一種生產(chǎn)純度較高、雜質(zhì)較少河豚毒素的方法，但該技術(shù)方案同樣存在著制備周期過(guò)長(zhǎng)、不宜用于大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)等方面的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述雖然目前提取、提純河豚毒素的方法繁多，但這些方法多多少少都存在著一定的缺陷，如產(chǎn)出純度高的高效液相法也存在這設(shè)備昂貴(高壓液相儀)的問(wèn)題，又例如浸漬分餾法，存在著效率低下、產(chǎn)品純度不高等問(wèn)題，提供了一種能夠大規(guī)模提取制備河豚毒素的方法，該方法工藝簡(jiǎn)單、高效，產(chǎn)率高，品質(zhì)優(yōu)良，產(chǎn)品純度高于99.5％，直接符合生物學(xué)研究和臨床應(yīng)用的要求。