[發明專利]一種制備高純河豚毒素的方法

在審

• 申請號: 201710931458.2
• 申請日: 2017-10-09
• 公開（公告）號: CN107880054A
• 公開（公告）日: 2018-04-06
• 發明（設計）人: 曾軍杰;張小軍;陳思;盧義博;李奇富
• 申請（專利權）人: 浙江省海洋水產研究所;江蘇美正生物科技有限公司
• 主分類號: C07D491/22
• 分類號: C07D491/22;A61K31/529;A61P25/30;A61P25/36;A61P25/04;A61P25/20;A61P23/02;A61P9/12;A61P9/00
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司33109
• 代理人: 尉偉敏

1.一種制備高純河豚毒素的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

1）將河豚內臟搗碎、勻漿，倒入pH值為3.5-4.5的醋酸水溶液加熱煮沸，冷卻后加入與醋酸水溶液等體積的甲醇-水溶液，經200-300r/m轉速攪拌后用篩絹過濾收集濾液，濾渣重復上述操作3-5次，將濾液合并后以板框壓濾機壓濾得到橙黃色毒液；

2）橙黃色毒液濃縮脫脂后，在低溫條件下以活性炭脫色純化，濾出活性炭，再加入大孔吸附劑同時以90-120r/m轉速攪拌進一步吸附純化，反應30-35min，布氏漏斗抽濾得到淺黃色毒液；

3）將淺黃色毒液通過陽離子交換樹脂柱，至樹脂吸附至飽和狀態后以去離子水洗陽離子交換樹脂柱，再以醋酸-醇-水體系溶液洗脫，收集洗脫液；

4）對洗脫液進行冷凍干燥和減壓濃縮，至洗脫液體積減少至原體積的1/3-1/4得到濃縮河豚毒素毒液，以納濾膜對濃縮河豚毒素毒液進行納濾收集濾液，再對濾液重復進行三次納濾處理，得到無雜質河豚毒素毒液；

5）將無雜質河豚毒素毒液通過交聯葡聚糖凝膠柱，以去離子水洗交聯葡聚糖凝膠柱，再用pH值為3-4的醋酸水溶液洗脫，收集洗脫液得到液態河豚毒素粗品；

6）向液態河豚毒素粗品中滴加氨水調節pH至9-10，優選調節pH至9.2-9.5，在低溫減壓環境下靜置20-24h，得到河豚毒素粗品；

7）將河豚毒素粗品溶于以醋酸-醇體系溶液溶解，再滴加氨水調節pH至9-10，優選調節pH至9.2-9.5，在低溫減壓環境下靜置20-24h，得到所需河豚毒素。

2.根據權利要求1所述的一種制備高純河豚毒素的方法，其特征在于，步驟1）中甲醇-水溶液中甲醇含量為8-10%，篩絹孔徑為350目。

3.根據權利要求1所述的一種制備高純河豚毒素的方法，其特征在于，步驟2）中所述低溫為2-5℃；大孔吸附劑為D101大孔吸附劑或D201大孔吸附劑中的至少一種。

4.根據權利要求1所述的一種制備高純河豚毒素的方法，其特征在于，步驟3）醋酸-醇-水體系溶液中醇為甲醇或乙醇中的至少一種，醋酸含量為0.8-1.2%，醇含量為10-12%，余量為水。

5.根據權利要求1所述的一種制備高純河豚毒素的方法，其特征在于，步驟4）中納濾所施外壓為0.1-6MPa，納濾膜孔徑為1-10nm。

6.根據權利要求1或5所述的一種制備高純河豚毒素的方法，其特征在于，步驟4）中納濾所施外壓優選為0.2-0.3MPa，納濾膜孔徑為1-2nm。

7.根據權利要求1所述的一種制備高純河豚毒素的方法，其特征在于，步驟5）中交聯葡聚糖凝膠柱型號為Sephadex G-10、Sephadex G-15、Sephadex G-25、Sephadex G-50、Sephadex G-75、Sephadex G-100、Sephadex G-150和Sephadex G-200中的任意一種。

8.根據權利要求1和7所述的一種制備高純河豚毒素的方法，其特征在于，步驟5）中交聯葡聚糖凝膠柱型號優選為Sephadex G-10。

9.根據權利要求1所述的一種制備高純河豚毒素的方法，其特征在于，步驟6）和步驟7）中所述低溫為2-8℃，優選為2-5℃；低壓為0.1-10Pa，優選為0.8-1.1Pa。

10.根據權利要求1所述的一種制備高純河豚毒素的方法，其特征在于，所述步驟6）和步驟7）中滴加氨水調節pH值均優選為調節pH值至9.2-9.5。