[發明專利]一種異檸檬酸裂解酶活性測定試劑盒及其方法

在審

• 申請號: 201710928061.8
• 申請日: 2017-10-09
• 公開（公告）號: CN107796770A
• 公開（公告）日: 2018-03-13
• 發明（設計）人: 姚金美;趙林川
• 申請（專利權）人: 蘇州科銘生物技術有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31
• 代理公司: 上海申新律師事務所31272
• 代理人: 閔東

1.一種異檸檬酸裂解酶活性測定試劑盒，其特征在于，包括以下試劑：

提取液，液體100mL×1瓶，由Tris-HCl緩沖溶液、KCl、MnCl₂、DTT和EDTA混合而成，并調pH至7.0，置于100mL容量瓶中，4℃保存；

試劑一，液體15mL×1瓶，由磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液和水混合而成，置于15mL試劑瓶中，4℃保存；

試劑二，粉劑×1瓶，由MgCl₂·6H₂O、DTT和NADH混合而成，置于1.5mL EP管中，-20℃保存；

試劑三，液體360μL×1支，由乳酸脫氫酶組成，置于1.5mL EP管中，4℃保存；

試劑四，粉劑×1瓶，由異檸檬酸組成，置于5mL試劑瓶中，4℃保存。

2.根據權利要求1所述的異檸檬酸裂解酶活性測定試劑盒，其特征在于：所述提取液中含有的Tris-HCl緩沖溶液的物質的量濃度為100mmol/L ，pH為7.0，體積為100mL，KCl的質量為150mg，MnCl₂的質量為99mg，DTT的質量為31mg，EDTA的質量為3mg。

3.根據權利要求1所述的異檸檬酸裂解酶活性測定試劑盒，其特征在于：所述試劑一中含有的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液的物質的量濃度為0.1mmol/L，pH為7.0，體積為3.85mL，水的體積為11.15mL。

4.根據權利要求1所述的異檸檬酸裂解酶活性測定試劑盒，其特征在于：所述試劑二中含有的MgCl₂·6H₂O的質量為20mg，DTT的質量為3mg，NADH的質量為4.5mg。

5.根據權利要求1所述的異檸檬酸裂解酶活性測定試劑盒，其特征在于：所述試劑三中含有的乳酸脫氫酶的酶濃度為500U/mL，體積為360uL。

6.根據權利要求1所述的異檸檬酸裂解酶活性測定試劑盒，其特征在于：所述試劑四中含有的異檸檬酸的質量為25.8mg。

7.一種采用如權利要求1所述的試劑盒的異檸檬酸裂解酶活性測定方法，其特征在于，基于微量法，具體步驟如下：

步驟1 儀器和用品的準備；

準備酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、移液器、微量石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水；

步驟2 樣本的前處理；

對于細菌或培養細胞的前處理，具體操作如下：

先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；然后按照細菌或細胞數量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例，超聲波破碎細菌或細胞；最后采用離心率15000g，4℃下離心10min，取上清，置冰上待測；

對于組織的前處理，具體操作如下：

先按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例，進行冰浴勻漿，然后采用離心率15000g，4℃下離心10min，取上清，置冰上待測；

步驟3將酶標儀預熱30min以上，調節波長至340nm，蒸餾水調零；

步驟4樣本測定；

1）工作液的配置，將試劑二和試劑三轉移至試劑一中，充分混合溶解，置于37℃或25℃水浴5min；

2）在試劑四中加入4mL蒸餾水，充分溶解待用；3）在微量石英比色皿中加入10μL樣本、150μL所述工作液和40μL試劑四，混勻，立即記錄340nm處20s時的吸光值A1和2min20s后的吸光值A2，計算ΔA=A1-A2；

步驟5異檸檬酸裂解酶活性計算；

1）按樣本蛋白濃度計算：

ICL（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V_反總÷（ε×d）×10⁹]÷（V_樣×Cpr）÷T = 3216×ΔA÷Cpr；

2）按樣本鮮重計算：

ICL（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V_反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W×V_樣÷V_樣總）÷T = 3216×ΔA÷W；

3）按細菌或細胞密度計算：

ICL（nmol/min/10⁴ cell）= [ΔA×V_反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V_樣÷V_樣總）÷T = 6.25×ΔA；

其中，V_反總表示反應體系總體積，且V_反總=2×10^-4 L；

ε表示NADH摩爾消光系數，且ε=6.22×10³ L/mol/cm；

d表示微量石英比色皿光徑，且d=0.5cm；

V_樣表示加入樣本體積，且V_樣=0.01mL；

V_樣總表示加入提取液的體積，且V_樣總=1mL；

T表示反應時間，且T=2 min；

Cpr表示樣本蛋白質的濃度，其單位為mg/mL；

W表示樣本的質量，其單位為g；

500表示細菌或細胞總數，代表500萬個。

8.根據權利要求7所述的異檸檬酸裂解酶活性測定方法，其特征在于：步驟2的1）中，所述的超聲波破碎細菌或細胞的方法為先冰浴，然后采用功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次。