[發(fā)明專利]RT-qPCR檢測獼猴SLC22A11/OAT4基因轉(zhuǎn)錄水平的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710902524.3
• 申請日: 2017-09-29
• 公開（公告）號: CN108330175A
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 唐東紅;王陳蕓;葉尤松;李哲麗;肖涵;邱炳玲;陳倩;楊浩;楊忠;馬開利;魯帥堯
• 申請（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 昆明正原專利商標(biāo)代理有限公司 53100
• 代理人: 徐玲菊

本發(fā)明提供一種RT?qPCR檢測獼猴SLC22A11/OAT4基因轉(zhuǎn)錄水平的方法，以樣品總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板，利用PCR引物組合進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，得到獼猴SLC22A11/OAT4基因片段的擴(kuò)增產(chǎn)物，以零點(diǎn)作對照，均一化后的基因倍數(shù)表達(dá)，獲得相對表達(dá)值，根據(jù)所得相對表達(dá)值即可計算出不同生理狀況下獼猴SLC22A11/OAT4基因mRNA的相對表達(dá)值，并根據(jù)相對表達(dá)值的大小定量檢測獼猴SLC22A11/OAT4基因轉(zhuǎn)錄水平變化，為研究獼猴SLC22A11/OAT4功能以及相關(guān)藥物對其影響提供有效途徑。本發(fā)明適用于實(shí)時定量PCR檢測，操作簡單，可重復(fù)性高，檢測成本低、靈敏性高、特異性強(qiáng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種檢測方法，尤其是涉及一種用實(shí)時熒光定量RT-qPCR法檢測獼猴有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員SLC22A11/OAT4基因轉(zhuǎn)錄水平的方法，屬于分子生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

近年來，全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association studies，GWAS)已檢出多個導(dǎo)致高尿酸血癥和痛風(fēng)的易感位點(diǎn)及相關(guān)候選基因。其中SLC2A9、SLC22A11 和SLC22A12基因功能缺失性突變可引起遺傳性低尿酸血癥，而過表達(dá)則會加強(qiáng)尿酸的重吸收。ABCG2、SLC17A1 和SLC17A3 基因功能缺陷型變異會降低腎臟和腸道對尿酸的排泄量。有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員SLC22A11/OAT4在近曲小管細(xì)胞中表達(dá)并錨定于頂膜，OAT4被證明為不對稱低親和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，利用有機(jī)陰離子與二羧酸鹽交換的形式對尿酸重吸收。研究顯示SLC22A11/OAT4作用于機(jī)體腎臟近曲小管對尿酸的重吸收。

近年來，由于飲食結(jié)構(gòu)和生活習(xí)慣的改變，高尿酸血癥（hyperuricemia，HUA）的患病率逐年增高，流行病學(xué)研究資料表明高尿酸血癥和原發(fā)性痛風(fēng)的發(fā)病呈上升趨勢，在中國，已經(jīng)有1.2億的HUA人群，大約占總?cè)丝诘?0%，中老年及絕經(jīng)后的婦女為高發(fā)人群，近年來發(fā)病年齡也呈年輕化的趨勢。高尿酸血癥與肥胖、高血壓、高脂血癥、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、胰島素抵抗的發(fā)生密切相關(guān)，已成為識別代謝綜合征的早期標(biāo)志，血液尿酸水平受肝臟中尿酸的產(chǎn)生量及腎臟和腸的排泄與重吸收平衡狀態(tài)的影響，所以對體內(nèi)尿酸穩(wěn)態(tài)的控制是治療高尿酸血癥和痛風(fēng)的關(guān)鍵。無論是藥物的篩選, 還是致病機(jī)制的研究，都需要科學(xué)、合理的動物模型來開展高尿酸血癥致病機(jī)理的研究及開發(fā)相關(guān)降血尿酸的藥物。

獼猴(Macaca Malatta)，又名恒河猴（rhesus monkey），由于在形態(tài)學(xué)、生理生化代謝等方面與人類非常相似，是較為理想的實(shí)驗(yàn)動物。其尿酸代謝途徑與人類相似，是研究該病的最佳實(shí)驗(yàn)動物，研究成果具有極高的轉(zhuǎn)化能力。為了利用人類的近親—獼猴來開展高尿酸血癥致病機(jī)理的研究及開發(fā)相關(guān)降血尿酸的藥物，需要建立一種獼猴有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員SLC22A11/OAT4mRNA 表達(dá)的相對定量方法，以研究藥物作用獼猴體內(nèi)SLC22A11/OAT4mRNA基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，進(jìn)而為研究SLC22A11/OAT4功能及其對機(jī)體血清尿酸的影響因素打下基礎(chǔ)。因此，建立qPCR檢測獼猴有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族成員SLC22A11/OAT4mRNA基因轉(zhuǎn)錄水平的方法，對于開展利用動物模型進(jìn)行的HUA發(fā)病機(jī)制研究及新藥篩選具有重要意義。