[發(fā)明專利]一種制備鯉魚肌肉細胞外結(jié)締組織掃描電鏡樣品的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710865046.3
• 申請日: 2017-09-22
• 公開（公告）號: CN107843609B
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 梁佳
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: G01N23/2202
• 分類號: G01N23/2202
• 代理公司: 北京國翰知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11696
• 代理人: 吳勝平

本發(fā)明公開了一種制備鯉魚肌肉細胞外結(jié)締組織掃描電鏡樣品的方法，具體步驟為：將肌肉放入前固定液中固定，吸出前固定液，再加入NaOH溶液震蕩，清洗；將樣品放入單寧酸溶液中固定，清洗后用四氧化鋨固定，清洗后再用冷凍保護劑溶液沖洗；接著用甲醇按濃度梯度由低到高順序脫水；將脫水樣品放入甲醇溶液中，用液氮快速凍結(jié)，切樣，用叔丁醇進行置換；再將樣品冷凍干燥；最后將干燥好的樣品進行拍照記錄。有益效果為：本發(fā)明方法能保證樣品在去除細胞質(zhì)后結(jié)構(gòu)完整，不會使結(jié)締組織隨細胞質(zhì)溶解或部分溶解，保持結(jié)締組織的完整性，使得掃描電鏡觀察的結(jié)締組織結(jié)構(gòu)清晰、圖像立體感強，能更好地觀察到較好的細微結(jié)構(gòu)特征。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及顯微觀察樣品技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種制備鯉魚肌肉細胞外結(jié)締組織掃描電鏡樣品的方法。

背景技術(shù)

掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）已廣泛地應(yīng)用于生物學、醫(yī)學、化學、環(huán)境、材料、石油地質(zhì)、礦物等眾多領(lǐng)域。隨著掃描電子顯微鏡分辨率的不斷提高和樣品制備技術(shù)的逐漸完善，尤其在生物學研究中發(fā)揮了巨大作用，具有重要的實用價值。在植物學方面，觀察葉表皮、種子、花粉、袍子囊和袍子等，解決形態(tài)解剖及分類問題，研究基因工程對植物的影響；在植物病理學方面，觀察病原菌形態(tài)、生長狀況和侵染宿主的過程，觀察真菌抱子的萌發(fā)、菌絲生長，寄主植物與病原菌的相互作用，生防菌的抬抗作用等；在微生物方面，為微生物資源的利用，微生物生物技術(shù)、遺傳工程、環(huán)境保護等提供了大量直觀的、有科研價值的形態(tài)學依據(jù)；在動物學研究方面，觀察細胞組織表面特征結(jié)構(gòu)、培養(yǎng)細胞的形態(tài)等，研究形態(tài)與功能的關(guān)系，但在水生生物方面的研究存在一定的限制，特別對鯉魚肌肉細胞外結(jié)締組織顯微結(jié)構(gòu)觀察之前的樣品制備研究技術(shù)尚不成熟，通過常規(guī)的制備掃描電鏡觀察樣品的方法獲得的樣品，在預(yù)處理時經(jīng)常出現(xiàn)結(jié)締組織隨細胞質(zhì)溶解或部分溶解，觀察時存在結(jié)締組織纖維結(jié)構(gòu)不完整、圖像不清晰的問題。

現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號為CN 102607908 B的中國發(fā)明專利，公開了一種淡水魚類精子掃描電鏡樣品制備方法，具體方法為：一、固定液配制；二、樣品固定；三、樣品臺準備；四、樣品滴片；五、樣品鍍膜，即完成淡水魚類精子掃描電鏡樣品制備。上述制備方法簡便、易操作，精子完整率高、分布密度適中，技術(shù)成本低，但是該制備方法會使結(jié)締組織隨細胞質(zhì)溶解或部分溶解，使得掃描電鏡照片不完整或不清晰。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種制備鯉魚肌肉細胞外結(jié)締組織掃描電鏡樣品的方法，該制備方法能夠保證樣品在處理時去除細胞質(zhì)后掃描電鏡樣品結(jié)構(gòu)完整，掃描電鏡觀察的結(jié)締組織結(jié)構(gòu)清晰，圖像立體感強。

本發(fā)明針對背景技術(shù)中提到的問題，采取的技術(shù)方案為：一種制備鯉魚肌肉細胞外結(jié)締組織掃描電鏡樣品的方法，包括前固定、后固定、脫水、割斷和置換、冷凍干燥、觀察，制備的具體步驟為：

前固定：將鯉魚背部肌肉避開隔膜切成塊，放入前固定液中固定4-5d，每22-24h更換一次固定液，然后吸出前固定液，加入1.8-2.2M NaOH溶液震蕩3-4d，每22-24h更換一次NaOH溶液，吸出NaOH溶液，再用0.09-0.11M的磷酸緩沖液清洗10-14h，即得前固定樣品，上述前固定液中仲甲醛濃度為1.9-2.1%、戊二醛濃度為2.3-2.6%、磷酸緩沖液濃度為0.09-0.11M，前固定液的pH為7.0-7.3，用戊二醛和仲甲醛進行前固定效果遠遠好于單一戊二醛固定，穿透能力強，能更好地凝固組織細胞中的蛋白成分，利于組織堅硬，穩(wěn)定細胞膜結(jié)構(gòu)，使得在后續(xù)脫水過程中不易產(chǎn)生收縮，同時NaOH溶液的加入能除去彈性纖維和細胞質(zhì)，減少雜質(zhì)對結(jié)締組織的影響，進而提高掃描電鏡的清晰度，而且不會使結(jié)締組織細胞隨細胞質(zhì)溶解或部分溶解，保持結(jié)締組織細胞的完整性；