[發明專利]一種制備鯉魚肌肉細胞外結締組織掃描電鏡樣品的方法

有效

• 申請號: 201710865046.3
• 申請日: 2017-09-22
• 公開（公告）號: CN107843609B
• 公開（公告）日: 2020-07-14
• 發明（設計）人: 梁佳
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: G01N23/2202
• 分類號: G01N23/2202
• 代理公司: 北京國翰知識產權代理事務所(普通合伙) 11696
• 代理人: 吳勝平

1.一種制備鯉魚肌肉細胞外結締組織掃描電鏡樣品的方法，包括前固定、后固定、脫水、割斷和置換、冷凍干燥、觀察，其特征在于：

所述的前固定步驟為：將鯉魚背部肌肉避開隔膜切成塊，放入前固定液中固定，然后吸出前固定液，再加入NaOH溶液震蕩，吸出NaOH溶液，最后用磷酸緩沖液清洗；

所述的后固定步驟為：將前固定后樣品放入單寧酸溶液中固定，然后用0.09-0.11M磷酸緩沖液清洗9-12min，反復清洗3-4次，再用四氧化鋨固定，最后用0.09-0.11M磷酸緩沖液清洗9-12min，反復清洗3-4次，再用冷凍保護劑溶液清洗9-12min，反復清洗3-4次，即得后固定樣品；

所述的脫水步驟為：將后固定樣品用體積濃度為50-90％的甲醇按濃度梯度由低到高順序逐次脫水14-16min，最后用98-100％甲醇反復脫水3-4次，每次脫水14-16min；

所述的割斷和置換步驟為：將脫水樣品放入98-100％甲醇溶液中，利用液態氮快速凍結，凍結的試樣用刀片迅速切斷，放入叔丁醇中進行置換3-4次，每次14-16min；

所述的冷凍干燥步驟為：將割斷、置換后的樣品利用凍結干燥裝置進行冷凍干燥處理，即得干燥樣品；

所述的觀察步驟為：將干燥好的樣品粘附在樣品臺上，進行噴金處理，然后用掃描電子顯微鏡進行拍照記錄，觀察樣品的表面和內部結構；

所述的前固定步驟中NaOH溶液濃度為1.8-2.2M，震蕩3-4d，每22-24h更換一次NaOH溶液；

所述的后固定步驟中冷凍保護劑的濃度為2-3％，冷凍保護劑為海藻糖和糖苷，其重量比為1:0.6-0.8；

所述的后固定步驟中糖苷中左旋糖苷和右旋糖苷的比為1:83-92。

2.根據權利要求1所述的一種制備鯉魚肌肉細胞外結締組織掃描電鏡樣品的方法，其特征在于：所述的前固定步驟中前固定液中仲甲醛濃度為1.9-2.1％、戊二醛濃度為2.3-2.6％、磷酸緩沖液濃度為0.09-0.11M，pH為7.0-7.3，前固定液固定4-5d，每22-24h更換一次固定液。

3.根據權利要求1所述的一種制備鯉魚肌肉細胞外結締組織掃描電鏡樣品的方法，其特征在于：所述的前固定步驟中磷酸緩沖液的濃度為0.09-0.11M，清洗10-14h。

4.根據權利要求1所述的一種制備鯉魚肌肉細胞外結締組織掃描電鏡樣品的方法，其特征在于：所述的后固定步驟中單寧酸溶液的濃度為1.8-2.1％，固定1.5-2.5h，四氧化鋨的濃度為0.8-1.1％，固定1.5-2.5h。