[發明專利]一種同時檢測多種腫瘤標志物的3D折疊紙基微流體熒光檢測裝置

有效

• 申請號: 201710852160.2
• 申請日: 2017-09-19
• 公開（公告）號: CN107478631B
• 公開（公告）日: 2019-10-11
• 發明（設計）人: 于海東;焦鈺翠;李林;張承武;劉志鵬;劉金華;黃維;歐陽啟然;賴瓊宇;郭雪英;宗麗君;朱成顯
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N33/533;G01N33/574
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 吳頻梅

1.一種同時檢測多種腫瘤標志物的3D折疊紙基微流體熒光檢測裝置，其特征在于：包括以下步驟：

（1）紙基微流體芯片的制作；

在計算機上設計出3D紙基的圖形，構成可折疊的三維親水和疏水區域，用于同時檢測多種腫瘤標志物，在紙基2、3兩層增加檢測區域孔的數目為2-5 ，即可增加同時檢測的標志物種類數為 2-5，并用噴蠟打印機打印，放進烘箱烘烤一段時間，取出冷卻至室溫，將紙基沿著打印區域剪下，并進行三維折疊；

（2）紙基微流體芯片的預處理；

將烘烤好的紙基微流體芯片的第3層用等離子清洗機進行氧氣等離子體處理，使紙表面的碳自由基形成氧自由基，導致醛基的產生，此目的是便于抗體在紙上的固定；

（3）三維紙基同時檢測的免疫反應程序；

首先在等離子體處理過的紙基微流體芯片的第3層分別固定2-5種腫瘤標志物的包被抗體，然后用阻隔液阻隔紙上的結合位點，在紙基微流體芯片的第2層加入對應的2-5種腫瘤標志物的異硫氰酸熒光素標記抗體，將紙基微流體芯片的1、2兩層對疊，在紙基微流體芯片的的第1層樣品區加入待測抗原混合液，最后將三層全部對疊，進行免疫反應；

（4）熒光分析檢測；

將紙基微流體芯片的第3層置于特定的激發光源下，根據可視化的熒光強弱評估2-5種腫瘤標志物濃度，將第3層的紙基微流體芯片用熒光分光光度計測定發射波長峰值，可精確得出檢測的2-5種腫瘤標志物濃度。

2.根據權利要求1所述的同時檢測多種腫瘤標志物的3D折疊紙基微流體熒光檢測裝置，其特征在于：在紙基2、3兩層增加檢測區域孔的數目為3，可同時檢測的標志物種類數3種。

3.根據權利要求2所述的同時檢測多種腫瘤標志物的3D折疊紙基微流體熒光檢測裝置，其特征在于：

(1)紙基微流體芯片的制作，使用的是規格為20cm×20cm的沃特曼1號色譜紙；

（2）紙基微流體芯片的預處理，將烘烤完成第3層紙基微流體芯片，放入等離子清洗機進行表面改性4min，利用氧氣表面等離子體處理使紙的表面帶上醛基便于抗體固定，在等離子體條件下，紙基纖維素上的碳自由基 - ?CH-OH上的羥基會失去氫原子，從而形成氧自由基 - ?O-CH2-，然后，該氧自由基上的單個電子與碳上的電子結合，導致醛基的產生；

（3）在熒光免疫反應程序中，首先在醛基改性過的紙基微流體芯片第3層G、H、I上分別固定4μL、40μg/mL的3種腫瘤標志物的包被抗體，J作為空白對照，在室溫下反應30min后，用20μL、0.01molPH=7.4的磷酸緩沖液沖洗3次，然后再依次加入0.5%的BSA阻隔紙上未與抗體結合的特異性位點，室溫下反應15min后用20μL、0.01molPH=7.4的磷酸緩沖液沖洗3次，在紙基微流體芯片第2層C、D、E上分別加入4μL、40μg/mL 對應的三種腫瘤標志物的異硫氰酸熒光素標記抗體，2min后將紙基微流體芯片的1、2兩層對疊，在紙基微流體芯片第1層的A孔中加入20μL 的待測腫瘤標志物混合液，反應2min后將三層全部對疊，并在紙基微流體芯片第1層的A孔中加入40μL、0.01molPH=7.4的磷酸緩沖液將抗原與標記抗體復合物沖到3層；反應4min后用40μL、0.01molPH=7.4的磷酸緩沖液沖洗3次，并用吸收墊吸收廢液；

（4）將紙基微流體芯片放到波長為470nm的激發光源下照射，可根據黃綠色熒光的強弱與比色卡進行比較視覺讀出讀數；將紙基微流體芯片放入樣品板，用熒光分光光度計在波長為470nm的激發光下進行掃描，可根據熒光光譜的峰值精確地分別得出各種腫瘤標志物的濃度。