[發明專利]均環肽Cyclo-(Cys)6

有效

• 申請號: 201710851622.9
• 申請日: 2017-09-19
• 公開（公告）號: CN107474118B
• 公開（公告）日: 2020-07-28
• 發明（設計）人: 宋宏濤;張雅婷;安友;黃瑋
• 申請（專利權）人: 中國工程物理研究院核物理與化學研究所
• 主分類號: C07K7/64
• 分類號: C07K7/64;C07K1/06;C07K1/04;C07K1/16
• 代理公司: 北京遠大卓悅知識產權代理事務所(普通合伙) 11369
• 代理人: 鄭健

1.一種均環肽Cyclo-(Cys)₆的制備方法，其特征在于，包括：

步驟一、將樹脂溶脹后除去溶劑，取氨基帶芴甲氧羰酰基保護基和側鏈巰基帶三苯甲基保護基的半胱氨酸、N,N-二異丙基乙胺DIEA加入樹脂中，再加入二甲基甲酰胺DMF使之溶解，室溫下震蕩反應30～60min；然后加入甲醇孵育20min；用DMF和甲醇溶劑反復清洗樹脂并抽掉溶劑，第一個氨基酸連接在樹脂上；去掉溶劑后，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保護基芴甲氧羰酰基；取樣檢測確保氨基酸已經連接在樹脂上，且已裸露出不帶保護的氨基；

步驟二、在步驟一得到的產物中再次加入氨基帶芴甲氧羰酰基保護基和側鏈巰基帶三苯甲基保護基的半胱氨酸，同時加入縮合試劑，與樹脂上氨基酸進行縮合，然后去掉溶劑后，加入裂解液，去除半胱氨酸氨基上的保護基芴甲氧羰酰基，取樣檢測后，再重復四次上述操作，直至半胱氨酸偶聯完全，脫除最后一個半胱氨酸氨基上的保護基芴甲氧羰酰；

步驟三、在步驟二得到的產物中加入切割液，將縮合好的直鏈肽從樹脂上切割下來；用旋轉蒸發儀除去切割液，得到帶保護的肽段；用二氯甲烷將帶保護的肽段溶解，加入環化試劑，完成環化反應；采用旋轉蒸發儀除去溶劑，加入裂解液，脫除巰基上的三苯甲基保護基；用冰乙醚沉降離心，再用乙醚洗滌沉降物3次，然后常溫揮發至干，得到環肽粗品；

步驟四、將得到的環肽粗品用少量乙腈溶解，在高效液相色譜儀上梯度淋洗純化，凍干即可得到白色粉末狀的環肽純品，密封包裝，-20℃保存；

所述步驟三中，完成環化反應后，將物料加入密封容器中，密封，然后置于2.5MeV、40mA的電子加速器中進行輻照攪拌處理，輻照劑量率為50～100Gy.min^-1，輻照劑量為10～20kGy，攪拌速度為100～150r.min^-1；

所述樹脂為2-氯三苯甲基氯樹脂、4-甲苯氫胺樹脂、Wang樹脂中的任意一種，所述溶脹的條件為加二氯甲烷DCM浸泡，并震蕩30min；其中半胱氨酸與樹脂連接的位置為其羧基；

所述步驟一和步驟二中，取樣檢測的方法為：取幾粒樹脂，用乙醇充分清洗后，加入體積分數5％的茚三酮乙醇溶液、0.3％的抗壞血酸溶液、60％的苯酚溶液各一滴，同時加熱至105～110℃并保溫5min，如果樹脂顏色變為深藍色，則說明氨基酸已經連接在樹脂上，并已裸露出不帶保護的氨基；

所述步驟二中，半胱氨酸之間的縮合，采用的試劑及反應條件為：加入縮合試劑三倍摩爾過量，均用DMF溶解，然后立刻加入N-甲基嗎啡啉十倍摩爾過量或N,N-二異丙基碳二亞胺三倍摩爾過量，反應30min，反應后用DMF、甲醇、DMF交叉充分洗滌樹脂各兩遍后除去溶劑；所述縮合試劑為苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-羥基苯并三氮唑、2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯中的任意一種；

所述步驟三中，將直鏈肽從樹脂上切割下來時所選用切割液為：三氟乙酸和二氯甲烷組成的混合溶劑，其中三氟乙酸的體積分數為1～2％，切割條件為加入切割液后常溫孵育反應1～2h；所述步驟三中，直鏈肽環化反應的條件為：加入環化試劑苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯基三倍摩爾過量，用DMF溶解，然后立刻加入N-甲基嗎啡啉十倍摩爾過量，反應30min；

其中，均環肽Cyclo-(Cys)₆的結構式為：

2.如權利要求1所述的均環肽Cyclo-(Cys)₆的制備方法，其特征在于，所述步驟一和步驟二中，每次所加入的氨基帶芴甲氧羰酰基保護基和側鏈巰基帶三苯甲基保護基的半胱氨酸的用量均三倍摩爾過量于樹脂；所述步驟一和步驟二中，去除保護基芴甲氧羰酰基時，加入的裂解液為含20％哌啶的DMF溶液，浸泡5min，往復約4次，然后再依次用DMF、甲醇、DMF、DCM分別洗滌兩次，去除溶劑。

3.如權利要求1所述的均環肽Cyclo-(Cys)₆的制備方法，其特征在于，所述步驟三中，裂解液為為體積比為94.5:1:2.5:2的三氟乙酸、三異丙基硅烷、1,2-乙二硫醇和純水組成的混合液，反應條件為加入裂解液后孵育反應2～3h。