[發(fā)明專利]一步法實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)人上皮細(xì)胞粘附分子的試劑盒

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710842408.7
• 申請(qǐng)日: 2017-09-20
• 公開（公告）號(hào): CN109536584A
• 公開（公告）日: 2019-03-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 不公告發(fā)明人
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 安徽普元生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/6851
• 分類號(hào): C12Q1/6851
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發(fā)明為一種實(shí)時(shí)熒光定量RT?PCR檢測(cè)人上皮細(xì)胞粘附分子試劑盒，該試劑盒以mRNA為模板，使反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)過程中無需打開管蓋，避免了交叉污染，并可以精確定量檢測(cè)標(biāo)本中人上皮細(xì)胞粘附分子(Ep?CAM) 的mRNA表達(dá)量。該試劑盒可以用于臨床及科研中檢測(cè)患者外周血標(biāo)本中EP?CAM的表達(dá)，用以結(jié)直腸癌輔助診斷、指導(dǎo)治療及提示預(yù)后。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，為一種通過以mRNA為模板，使反轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行的檢測(cè)技術(shù)，可以精確定量檢測(cè)標(biāo)本中人上皮細(xì)胞粘附分子 (Ep-CAM) 的mRNA表達(dá)量的試劑盒。

背景技術(shù)

上世紀(jì)中期，隨著人們生存居住環(huán)境、飲食習(xí)慣以及生活水平的不斷改變、不斷提高，與此同時(shí)各類腫瘤的發(fā)病率/死亡率也呈逐年上升趨勢(shì)。結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率僅次于肺癌和乳腺癌，已成為第三惡性腫瘤。結(jié)直腸癌具有高度惡性與侵襲性的生物學(xué)特性，常發(fā)生浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移，此生物學(xué)特性是導(dǎo)致患者預(yù)后較差及死亡率較高的一個(gè)重要因素。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是與多基因相關(guān)、多因素相互影響、多步驟、錯(cuò)綜復(fù)雜循序漸進(jìn)的過程；然而其診治關(guān)鍵要點(diǎn)與大多數(shù)腫瘤一樣，在于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期治療。臨床研究表明，早期結(jié)直腸癌的手術(shù)治愈率可以達(dá)到 80%-90%，然而結(jié)直腸癌患者常常因早期缺乏特異性的臨床癥狀與體征，不易引起患者足夠的重視，難以在患病早期及時(shí)的發(fā)現(xiàn)并行手術(shù)治療。多數(shù)結(jié)直腸癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中期，甚至是晚期，即使行手術(shù)治療，也難以達(dá)到患者理想的效果，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率較高，生存期也較短，預(yù)后不佳。近幾年，以消化道內(nèi)鏡結(jié)合病理學(xué)檢查為主的診斷方法在臨床上廣泛應(yīng)用，但是針對(duì)我國(guó)目前醫(yī)療現(xiàn)狀來說，暫不適合大規(guī)模消化內(nèi)窺鏡篩查，進(jìn)而導(dǎo)致早期行手術(shù)治療率較低。臨床發(fā)現(xiàn)中晚期結(jié)直腸癌患者即使進(jìn)行手術(shù)治療，也有 30%-40%的患者術(shù)后出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移播散，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移目前導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者死亡最主要原因之一。近年來，結(jié)直腸癌治療及手術(shù)方案有了明顯的改善與進(jìn)步，同時(shí)各種后期治療手段如：放、化療在不斷更新與完善，生物治療、基因治療等新方法不斷涌現(xiàn)。血循環(huán)中存活的腫瘤細(xì)胞是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的基礎(chǔ)，盡管各種結(jié)直腸癌的各種檢測(cè)方法不斷的增多，然而這一類細(xì)胞數(shù)量極微，不易被臨床常規(guī)手段檢測(cè)出來。近年來，通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR) 技術(shù)檢測(cè)外周血中微量循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulatingtumor cell，CTC) 已成為可能并被嘗試。

上皮細(xì)胞粘附分子(Ep-CAM) 是上皮細(xì)胞上的跨膜糖蛋白，屬于上皮來源的腫瘤細(xì)胞。上世紀(jì)被發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于鑒定上皮源性腫瘤細(xì)胞。來源于間葉組織的血液細(xì)胞及骨髓細(xì)胞等都不表達(dá)Ep-CAM，而來源于上皮的腫瘤細(xì)胞卻呈高表達(dá)。Ep-CAM 與結(jié)直腸癌患者的腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移密切關(guān)聯(lián)。因此檢測(cè)結(jié)直腸癌患者外周血和淋巴結(jié)等標(biāo)本中有無Ep-CAM mRNA的表達(dá)，可以對(duì)上皮類來源的結(jié)直腸癌腫瘤的轉(zhuǎn)移診斷和治療提供有力證據(jù)，還可以對(duì)腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)情況以及療效觀察提供幫助。一步法熒光定量PCR技術(shù)使反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增在同一反應(yīng)體系中進(jìn)行，反應(yīng)過程中無需打開管蓋，避免交叉污染，節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間。具有方便、便捷、重復(fù)性好等特點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明試劑盒包含：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)液 (RT-PCR反應(yīng)液)、莫洛尼氏鼠白血病病毒 (M-MuLV) 逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑 (Rnasin)、耐熱性DNA聚合酶 (Taq DNA聚合酶)、標(biāo)準(zhǔn)品、陰陽(yáng)性對(duì)照品。

其中逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)液含有焦炭酸二乙酯處理的水、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈緩沖液、寡聚(dT)_15-18(Oligo(dT)_15-18)、dNTPs、MgCl₂、檢測(cè)用上下游引物、熒光探針。

檢測(cè)用引物分檢測(cè)用上游引物和檢測(cè)用下游引物：

上游引物序列為：5’—TTGCCGCAGCTCAGGAA—3’，

下游引物序列為：5’—AAAGCCCATCATTGTTCTGGA—3’，