[發明專利]一種雙通道熒光成像檢測活細胞中微量Fe3+、Hg2+和Cu2+的方法

在審

• 申請號: 201710836801.5
• 申請日: 2017-09-17
• 公開（公告）號: CN108181272A
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 曾晞;張紅;方浚安;廖賢;牟蘭
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C07D491/107;C09K11/06
• 代理公司: 北京聯創佳為專利事務所(普通合伙) 11362
• 代理人: 郭防;張梅

1.一種雙通道熒光成像分別檢測活細胞中微量Fe³⁺、Hg²⁺和Cu²⁺的方法，其特征在于：是以一種三胺乙基胺衍生物作為探針，通過雙通道熒光成像分別檢測活性細胞中微量Fe³⁺、Hg²⁺和Cu²⁺；所述的探針的化學結構式為：

2.如權利要求1所述的雙通道熒光成像分別檢測活細胞中微量Fe³⁺、Hg²⁺和Cu²⁺的方法，其特征在于：所述的以一種三胺乙基胺衍生物作為探針，通過雙通道熒光成像分別檢測活性細胞中微量Fe³⁺、Hg²⁺和Cu²⁺；是先用探針與細胞孵化使探針進入細胞內，再將孵化有探針的細胞分別與Fe³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺孵化，使探針分別與Fe³⁺、Hg²⁺、Cu²⁺在細胞內結合生成能發射特征波長熒光的探針-Fe³⁺、探針-Hg²⁺、探針-Cu²⁺配合物，實現探針對細胞內離子染色成像，用熒光倒置顯微鏡觀測孵化后的活性細胞熒光像；具體包括以下步驟：

(1)細胞培養：活性細胞經復蘇接種于培養液中，在溫度為37℃，5％CO₂及飽和濕度為100％的培養箱中培養，傳代后，接種于12孔板中培養，密度為2×10⁴個/ml，次日用新鮮培養液清洗細胞；所述的培養液含10％胎牛血清、1％雙抗以及89％改良型RPMI 1640培養基；

(2)探針對細胞孵育：將步驟(1)的細胞中加入含5～40μM探針的孵育培養液中，該孵育培養液的組成為90％培養液，8％H₂O，2％乙腈，培養箱內孵育30～80min，吸出含探針的孵育培養液，用新鮮的培養液清洗細胞，置于熒光倒置顯微鏡下分別進行明場和暗場拍照，明場下觀察到細胞清晰的圖像，暗場下沒有觀察到細胞圖像；

(3)Fe³⁺對細胞染色：在步驟(2)的細胞中加入含30～80μM Fe³⁺的染色培養液，該染色培養液的組成為95％培養液和5％H₂O，培養箱內孵育30～80min，吸出含Fe³⁺的染色培養液，用新鮮的培養液清洗細胞，置于熒光倒置顯微鏡的紅色通道下觀察探針對細胞內Fe³⁺染色后的熒光像，細胞呈現明亮的紅色熒光，拍攝得到清晰的紅色熒光細胞輪廓影像；再將上述經探針和Fe³⁺分別染色后的細胞置于熒光倒置顯微鏡的綠色通道下觀察探針對細胞內Fe³⁺染色后的熒光像，細胞呈綠色熒光，拍攝得到綠色熒光細胞輪廓影像，探針在活性細胞中檢測到微量Fe³⁺離子；

(4)Hg²⁺對細胞染色：在步驟(2)的細胞中加入含30～80μM Hg²⁺的染色培養液，該染色培養液的組成為95％培養液和5％H₂O，培養箱內孵育30～80min，吸出含Hg²⁺的染色培養液，用新鮮的培養液清洗細胞，置于熒光倒置顯微鏡的紅色通道下觀察探針對細胞內Hg²⁺染色后的熒光像，細胞呈現明亮的紅色熒光，拍攝得到清晰的紅色熒光細胞輪廓影像；再將上述經探針和Hg²⁺分別染色后的細胞置于熒光倒置顯微鏡的綠色通道下觀察探針對細胞內Hg²⁺染色后的熒光像，細胞呈綠色熒光，拍攝得到綠色熒光細胞輪廓影像，探針在活性細胞中檢測到微量Hg²⁺離子；

(5)Cu²⁺對細胞染色：在步驟(2)的細胞中加入含30～80μM Cu²⁺的染色培養液，該染色培養液的組成為95％培養液和5％H₂O，培養箱內孵育30～80min，吸出含Cu²⁺的染色培養液，用新鮮的培養液清洗細胞，置于熒光倒置顯微鏡的綠色通道下觀察探針對細胞內Cu²⁺染色后的熒光像，細胞呈明亮的綠色熒光，拍攝得到清晰的綠色熒光細胞輪廓影像，探針在活性細胞中檢測到微量Cu²⁺離子。