[發明專利]一種間充質干細胞體外成骨誘導分化的支架材料及其應用

有效

• 申請號: 201710796537.7
• 申請日: 2017-09-06
• 公開（公告）號: CN107446885B
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 王秀麗;曹旭鵬;龍燦玲;劉銘;徐紅;成旭
• 申請（專利權）人: 大連醫科大學
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61L27/38
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 劉慧娟;李馨

1.一種間充質干細胞體外成骨誘導分化的支架材料的制備方法，其特征在于：制備方法包括下述步驟：

(1)制備多孔蠶絲蛋白支架：將蠶繭于0.02M碳酸鈉溶液中進行萃取并溶解于9.3M溴化鋰溶液中，蒸餾水透析并離心，得到2.5g/mL絲素蛋白溶液；將甘油溶液與上述制備的絲素蛋白溶液以3:7的重量比預混合；將所得混合物冷凍干燥后切片獲得多孔蠶絲蛋白支架；

(2)將所述多孔蠶絲蛋白支架置于硅酶溶液中，在2-8℃條件下浸泡6-18h后，按照含硅化合物與硅酶質量比5～50:1的比例，加入溶液中，經25-37℃反應1-6h，PBS洗去反應液得硅包被多孔蠶絲蛋白支架；其中，所述含硅化合物選自硅酸鈉、六氟硅酸鈉、四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷；所述硅酶的氨基酸序列來自繁茂膜海綿的silicatein alpha蛋白基因。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述凍干為在-40℃下預冷凍6小時后，凍干36小時。

3.權利要求1所述的制備方法在間充質干細胞培養方法中的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：將人骨髓間充質干細胞以10⁵～10⁶細胞數/支架接種到硅包被多孔蠶絲蛋白支架上，并置于成骨誘導分化微環境中進行培養。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于：還包括將消化的人骨髓間充質干細胞與膠原混合，獲得細胞-膠原懸液后再接種至硅包被多孔蠶絲蛋白支架的步驟；且人骨髓間充干細胞數量為2～5×10⁵細胞數/支架，膠原的體積為5～15μL/支架。

6.根據權利要求4所述的應用，其特征在于：將硅包被多孔蠶絲蛋白支架置于成骨誘導分化微環境中進行培養的操作步驟如下：在37℃、5％CO₂的條件下凝膠化10～20min，然后加入成骨誘導培養基進行細胞培養，所述的成骨誘導培養基由高糖基礎培養基、10％胎牛血清、1％雙抗、100nM地塞米松、10μMβ-磷酸甘油、0.5μM抗壞血酸混合而成。

7.根據權利要求4所述的應用，其特征在于：在將人骨髓間充質干細胞接種到硅包被多孔蠶絲蛋白支架前所述支架需經滅菌處理，且浸泡在基礎培養基內進行預平衡10-14h。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于：所述滅菌處理方法選自高溫或高溫高壓滅菌方法，或乙醇滅菌方法。