[發(fā)明專利]一種測定甘露糖醛酸類物質重均分子量和含量的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710796485.3
• 申請日: 2017-09-06
• 公開（公告）號: CN109459505B
• 公開（公告）日: 2023-04-25
• 發(fā)明（設計）人: 曾洋洋;黃道林;張真慶
• 申請（專利權）人: 綠谷（上海）醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/74
• 代理公司: 北京市金杜律師事務所 11256
• 代理人: 陳文平;馬慧

本發(fā)明屬于天然藥物化學和質量控制領域，涉及一種測定甘露糖醛酸類物質的可溶性鹽重均分子量和含量的方法，包括使用甘露糖醛酸類物質的可溶性鹽樣品中的金屬離子含量對SEC?MALS測定酸性糖的重均分子量和含量結果進行校正。利用本發(fā)明方法可快速、準確測定甘露糖醛酸類物質的可溶性鹽w的重均分子量、含量。

技術領域

本發(fā)明屬于天然藥物化學和質量控制領域，涉及一種測定甘露糖醛酸類物質、特別是其可溶性鹽的重均分子量和含量的方法。

背景技術

甘露糖醛酸類物質主要來源于海藻酸鈉。海藻酸鈉經酸解分級后，得到聚甘露糖醛酸(分子量約在2k-10kDa)，聚甘露寡糖醛酸經氧化得到甘露寡糖二酸(分子量在400-3000Da之間)。甘露寡糖二酸是具有特定分子骨架的低分子海洋酸性寡糖類化合物，可用于抗阿爾茲海默病(AD)。臨床前藥效學等研究結果表明甘露寡糖二酸具有對神經細胞的保護作用，最終改善記憶功能障礙，從而有效治療阿爾茲海默病。通常以其可溶性鹽的形式用于制備藥物。中國專利申請CN1933845A及國際專利申請PCT/CN2016/113879公開了聚甘露糖醛酸及甘露寡糖二酸的相關情況。

中間體聚甘露糖醛酸及終產物甘露寡糖二酸的可溶性鹽的重均分子量和含量是研制甘露寡糖二酸藥物的重要測定參數(shù)。目前，中國藥典中，高效液相凝膠滲透色譜法(GelPermeation?Chromatography,GPC)是測定分子量的常規(guī)做法，其是按照排阻色譜的原理，不同分子量的多糖按照其大小順序先后流出色譜柱，通過一系列不同分子量標準多糖與保留時間的相關性測得的校正曲線并計算相應的待測多糖的相對分子量。但該常規(guī)方法必須要有相應的多糖標準品而有一定的局限性。

此外，多糖和寡糖含量的測定常用方法為硫酸咔唑法，該方法首先以濃度及單糖標準品的顯色做標準曲線，再在標準曲線上讀出待測樣品的含量。但是酸性糖的單糖甘露糖醛酸并沒有標準品出售，若以葡萄糖醛酸為標準品，其與酸性糖的結構及顯色效率存在差異，不能對酸性糖進行精確定量。

近年來出現(xiàn)的尺寸排阻色譜聯(lián)用多角度激光散射(Size-ExclusionChromatography/Multi-Angle?Laser?Light?Scattering，SEC-MALS)測定樣品絕對重均分子量、分子量分布和含量在業(yè)界引起了廣泛的關注。18角度激光光散射儀(MALS)工作原理是：激光束通過溶液會產生光散射，散射光強度與樣品分子量及溶液濃度成正比，不同散射角度的光強及分子尺寸有關，因此在樣品池周圍不同位置設立多個檢測探頭(分子量的測量精度與角度數(shù)目的平方根成正比)同時接收不同角度的散射光強度信號。依照光散射方程K*c/R(θ)＝1/M_WP(θ)+2A₂c作Zimm圖，即可得到大分子的重均絕對分子量Mw，均方旋轉半徑rg及第二維利系數(shù)A₂。MALS和尺寸排阻色譜(SEC)聯(lián)用，不必依賴泵的流速、校正曲線及其他錯誤的假設，即可直接求的分子量及分子量分布等數(shù)據(jù)。MALS利用色譜柱分離出的樣品在不同角度的光散射量，由示差折光(RI)檢測器得到洗脫液濃度及dn/dc值計算得到質量，綜合兩者即可計算出各個切片的分子量。該方法不需標準品校準，克服了樣品與標準品的化學組成、分子結構及大小不同帶來的相對分子量測定的誤差。已有研究者采用這一方法測定了殼聚糖、透明質酸的平均分子量(Monica?Fee,Neil?Errington,Kornelia?Jumel,et?al.Correlation?of?SEC/MALLS?with?ultracentrifμge?andviscometric?data?for?chitosans.Eur?Biophys?J(2003)32:457～464；Sanya?Hokputsa,Kornelia?Jumel,Catherine?Alexander,et?al.Comparison?of?molecular?massdetermination?of?Hyaluronic?acid?using?SEC/MALLS?and?sedimentationequilibrium.Eur?Biophys?J(2003)32:450～456)，還有研究者采用該方法對天然中性多糖進行定量，并預測該方法將成為多糖定量的一種常規(guī)技術(Kit-Leong?Cheong,Ding?taoWu,Jing?Zhao,et?al.A?rapid?and?accurate?method?for?the?quantitativeestimation?of?natural?polysaccharides?and?their?fractions?using?highperformance?size?exclusion?chromatography?coupled?with?multi-angle?laserlight?scattering?and?refractive?index?detector.Journal?of?Chromatography?A(2015)1400:98～106)。目前歐洲藥典已經采用此方法作為羥乙基淀粉重均分子量及分子量分布的測定方法(European?pharmacopoeia?8.0,p3307-3308,starcheshydroxyethyl)。