[發明專利]真菌快速保存方法

有效

• 申請號: 201710796139.5
• 申請日: 2017-09-06
• 公開（公告）號: CN107674838B
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發明（設計）人: 吳波明;郭芳芳;王寧;孫秋玉;陽威
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04;C12R1/645
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

本發明涉及真菌快速保存方法，采用改進的濾紙片法保存真菌，采用設有虛線的濾紙片保存真菌，菌絲可以透過濾紙生長，生長過程中接觸充足的營養，菌絲生長良好。本發明在貼紙片操作和回收紙片操作環節加以改進，可以大幅度節省時間，省時省力，且污染率較常規方法低，極大地提高了工作效率。該方法在貼紙片步驟中每貼一個培養皿的紙片要比傳統方法節省將近87％，在回收保存紙片步驟中每收一個培養皿的紙片要比傳統方法節省約55％，大大提高了工作效率、減輕了勞動強度。并且該方法所用時間短，在實際操作中很大程度上降低了污染率。

技術領域

本發明涉及微生物的保存方法，具體地說，涉及真菌快速保存方法。

背景技術

真菌是與人們生活緊密相關的一類生物，作為自然界的分解者是生物鏈的重要一環，也可以引起農作物、動物和人類的很多病害。例如，真菌引起的稻瘟病在氣象條件適合稻瘟病發生的情況下，可引起水稻大量減產，極端情況甚至顆粒無收。因此研究和理解真菌對發展科技，改善人民健康，保障我們的糧食安全等都具有重要意義。而這些研究都需要培養和保存大量的真菌。

真菌的保存方法有很多，有繼代培養保存法、礦物油保存法、蒸餾水保存法、甘油冷凍保存、低溫冷凍保存法、冷凍真空干燥保存法等。繼代培養保存法操作簡單，一般3-6月轉接一次。但是頻繁的轉接會使改變易發生變異真菌的生物性狀，如多次繼代會改變稻瘟菌的產孢能力和致病力，污染菌種的概率也較大。礦物油保存是在長滿真菌的斜面培養基上覆蓋一層礦物油，一般1年轉接一次，菌種特性不易發生改變，但是保存占用較大空間。蒸餾水保存是將菌絲塊放入蒸餾水中并密封放于室溫或4℃，可存活數年，但同樣不方便貯存。冷凍真空干燥保存法可以保存幾年、幾十年或者更長時間，避免多次轉接造成污染和變異，但技術、設備要求高，不適于普通實驗室大量采用。低溫冷凍保存法的菌絲或孢子附著載體為濾紙片、高粱粒、大麥粒或者稻稈等，冷凍條件為-20℃冰箱、-80℃冰箱或者液氮等。低溫干燥條件可以較好保存菌種的活性，在實驗室條件下也可以普遍采用。由于保存吸附在濾紙上的孢子需要抽取真空，步驟較為繁瑣，一般多保存菌絲。采用高粱粒、大麥粒、稻稈等載體可以大量保存菌種，但保存過程復雜，容易發生霉變污染，保存占用體積也較大。因此濾紙作為干燥菌絲是一個較好的選擇，通常的濾紙片低溫冷凍保存菌種的方法也較為經濟適用。操作方法是把濾紙片剪成3-5mm的小紙片，滅菌后貼在固體培養基上，待菌絲長滿培養基平面后即可回收濾紙片，干燥后裝入硫酸紙袋，置于低溫冷凍保存。但是貼濾紙片和回收濾紙片的過程較為費時費力且容易污染，對于大量稻瘟病菌及其他真菌保存來說更是需要較多時力。隨著研究范圍的不斷擴大和研究的深入，科研人員需要大量的真菌菌株作為研究樣本，并且需要作為菌種保存起來，方便日后的使用及研究。但是依靠以往的保存方法保存大量菌種需要大量的時力，甚至不能實現菌種的大批量保存。因此，亟待開發一種耗時短，效率高，污染少的方法進行妥善保存。

發明內容

本發明的目的是提供一種改進的濾紙片保存真菌的方法。

本發明構思如下：目前保存真菌的濾紙片法是將濾紙片剪成邊長0.3-0.5cm的小濾紙片，貼在培養基上。其不足之處在于將大紙片剪成小紙片效率低，將小紙片貼在培養基上費時費力，而且容易污染，菌絲長滿后回收紙片也較為耗時繁瑣。發明人力圖從濾紙片制作，貼紙片操作和回收紙片操作上加以改進，以提高工作效率，降低污染率。

為了實現本發明目的，本發明提供的真菌快速保存方法，采用改進的濾紙片法保存真菌，包括以下步驟：

1)將濾紙片用虛線刀劃間隔0.3cm-0.5cm的方格虛線，然后根據培養皿直徑大小，將濾紙片剪裁成與培養皿直徑大小相匹配的圓形、方形或多邊形，并在剪裁好濾紙片中央開設直徑為0.3cm-0.5cm的圓孔或邊長為0.3cm-0.5cm的方形孔，完成濾紙片制作；高溫滅菌；

2)配制培養基，滅菌后將培養基分裝在培養皿中，待培養基凝固后，將上述制作好的濾紙片貼在培養基上，將菌絲塊放在培養基中央，密封后置于培養箱中培養；