[發明專利]基于dPCR的新型全自動熒光信號采集分析方法

有效

• 申請號: 201710789184.8
• 申請日: 2017-09-05
• 公開（公告）號: CN107723344B
• 公開（公告）日: 2020-12-08
• 發明（設計）人: 帕維爾·諾伊茨爾;李樺楠;徐穎;張浩卿
• 申請（專利權）人: 西北工業大學
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;G01N21/64
• 代理公司: 西北工業大學專利中心 61204
• 代理人: 呂湘連

1.一種基于dPCR的新型全自動熒光信號采集分析方法，其特征在于包括如下步驟：

步驟1：制作dPCR芯片，dPCR芯片為利用微納米加工技術制作出的帶有十字標記的高密度微孔型dPCR芯片，其整體尺寸為N*N㎜，區域A為微反應腔的部分，邊緣尺寸為M*M㎜，在dPCR芯片邊緣和微反應腔A邊緣構成的環形區域內有六個特殊的十字標記P1，P2，P3，P4，P5，P6，規定dPCR芯片上與P1最接近的頂點為坐標原點，P1、P2中心點連線并指向P2的方向為x正方向，P1、P5中心點連線并指向P5的方向為y正方向，若設P1的中心坐標為P1(a,b)，0a,b(N-M)/2，則其他五點的中心坐標分別為P2(N-a,b)，P3(a，N/2)，P4(N-a，N/2)，P5(a，N-b)，P6(N-a，N-b)；該六個十字標記的中心所構成的矩形區域的大小為(N-2a)*(N-2a)；

步驟2：創建十字標記識別數據庫；對步驟1中的dPCR芯片拍攝，得到倍率大小、清晰度、十字標記完整度不完全相同的陽性圖片和陰性圖片，其中，陽性圖片是指含有十字標記的圖片，陰性圖片是指不含有十字標記的圖片；通過設定所有陽性圖片的含有十字標記的矩形區域，創建十字標記的識別數據庫；

步驟3：初始化，設定各方向和各頂點，采集圖像；該步驟由以下子步驟完成：

子步驟1：以P1、P2的中心點連線的方向作為水平方向，以P1、P5的中心點連線的方向作為豎直方向；將圖像信息轉換成矩陣，根據CCD照相機下一張圖片的像素大小e*f與相應的dPCR芯片微反應腔的尺寸d，找到像素與單位微米之間的換算關系；利用CCD照相機下一張圖片的像素大小e*f、dPCR芯片的尺寸N*N以及像素和微米之間的換算關系計算得到劃分采集區域的總數目sNr(1)*sNr(2)和可編程微動控制平臺的步進量stepSize(1)和stepSize(2),其中，sNr(1)和sNr(2)分別代表在水平方向和豎直方向所需采集照片的數目，stepSize(1)和stepSize(2)分別代表在水平方向和豎直方向上的步進量；由e-stepSize(1)和f-stepSize(2)得到相鄰兩張圖片之間的重疊距離overlap(1)和overlap(2)，overlap(1)和overlap(2)分別代表在水平方向和豎直方向上相鄰兩張圖片的重疊距離，判斷overlap(1)e/4～e/3并且overlap(2)f/4～f/3是否成立，如果成立，進行子步驟2，如果不成立，增大sNr并按照子步驟1所述方法重新計算stepSize和overlap，直至滿足條件為止，進行子步驟2；

子步驟2：從芯片的四個頂點中任選一個作為初始頂點，與該初始頂點最相近的一個十字標記記為Pz，z的取值為1,2,5,6，將含有初始頂點、Pz和部分微反應腔三部分的圖片作為第一張拍攝圖片，該圖片的位置即當前位置，當前位置坐標由初始頂點坐標來表示；

子步驟3：初始化當前位置為初始位置，初始位置坐標由當前位置坐標表示，從初始位置開始遍歷當前dPCR芯片的所有區域，遵循先水平方向后豎直方向的原則逐行掃描，掃描過程中，根據初始位置坐標及可編程微動控制平臺的步進量確定第j步移動后的理論位置坐標(X_j0,Y_j0)，同時可編程微動控制平臺根據上述計算的步進量stepSize完成第j步移動，移動后的位置坐標記為(X_j0’,Y_j0’)，判斷(X_j0,Y_j0)與(X_j0’,Y_j0’)是否相同，若相同，進行拍照等候下一步移動；若不同，可編程微動控制平臺連續五次嘗試移動到(X_j0,Y_j0)位置，在五次移動過程中，每次移動后的位置坐標記為(X_ji,Y_ji)，i＝1,2,3,4,5,第i次移動完成后，判斷(X_ji,Y_ji)與(X_j0,Y_j0)是否相同，并得到實際位置(X_ji,Y_ji)與理論位置(X_j0,Y_j0)的偏差er，若(X_ji,Y_ji)與(X_j0,Y_j0)相同，則進行拍照并進行第j+1步移動，若五次移動完成后(X_ji,Y_ji)與(X_j0,Y_j0)仍不同，則根據偏差er自動調整至理論位置(X_j0,Y_j0)，再進行拍照并進行第j+1步移動；

子步驟4：掃描全部完成，得到圖片O₁₁、O₁₂、……、O_sNr(2)sNr(1)，進行步驟4；

步驟4：在水平方向和豎直方向拼接圖片，每個方向上兩張待拼接圖片的位置分別有兩種情況，由以下子步驟來完成：

子步驟1：取第t行的前兩張圖片O_t1、O_ti，其中，t＝1,2,……,sNr(2)，i＝2,3,……，sNr(1)，設置具有1/30～1/50*overlap個像素點寬度的比較塊，在圖片O_t1、O_ti之間進行相關性比較，將k行q列比較區域內的相關性記為R1、R2、……、Rn，找到最大的相關性Rmax＝max{R1、R2、……、Rn}和重疊位置第k’行第q’列，則取O_t1的(k’+1：f’)行，(1，q’)列，取O_ti的(1：f-k’)行，(1，e)列，拼接成一張新的圖片并刪除原來的圖片O_t1，將新的圖片作為第t行第一張圖片，記為O_t1，再將O_t1與下一張圖片O_ti按照上述步驟進行拼接，依次類推，直至該行所有sNr(1)張圖片全部拼接完成；得到每行拼接完成的最新圖片O₁₁，O₂₁，……，O_t1，然后轉子步驟2；

子步驟2：記O₁₁，O₂₁，……，O_t1分別為O₁，O₂，……，O_t，取O₁、O_j兩張圖片，j＝2，3，……，t，設置具有1/30～1/50*overlap個像素點寬度的比較塊，在圖片O₁、O_j之間進行相關性比較，將kk行qq列比較區域內的相關性記為R11、R22、……、Rnn，找到最大的相關性Rmmax＝max{R11、R22、……、Rnn}和重疊位置第k”行第q”列，則取O₁的(1：k”)行，(1，q”)列，取Oj的(1：f2)行，(q”+1，e2)列，拼接成一張新的圖片并刪除原來的圖片O₁，將新的圖片作為當前第一張圖片，重新記為O₁，再將O₁與下一張圖片O_j按照子步驟2進行拼接，直至所有sNr(2)張圖片全部拼接完成，得到最新的完整圖片O₁，其大小記為N’*M’；

步驟5：將圖片O₁劃分為六個區域，分別記為M1，M2，M3，M4，M5，M6，每個區域的大小均為N’/2*M’/3，該六個區域內各含有一個十字標記；取Mi，i＝1，2,3,4,5,6，根據步驟2創建的十字標記識別數據庫識別Mi中的十字標記，并利用canny算子尋找十字標記的邊緣，通過霍夫轉換檢測并畫出相關直線，從而得到Mi中十字標記的四條邊緣直線，記為li1，li2，li3，li4；最后根據解析幾何的算法計算出四條直線的四個交叉點，記為vi1，vi2，vi3，vi4，從而得到六個標記的中心坐標，記為c1(X_c1，Y_c1)，c2(X_c2，Y_c2)，c3(X_c3，Y_c3)，c4(X_c4，Y_c4)，c5(X_c5，Y_c5)，c6(X_c6，Y_c6)；

步驟6：由tan^-1((Y_cj-Y_ci)/(X_cj-X_ci))，j＝2,4,6；i＝1,3,5，計算水平方向上c1和c2、c3和c4、c5和c6的相對偏轉角度并記為α1、α2、α3，由tan^-1((X_cj-X_ci)/(Y_cj-Y_ci))，j＝3,4,5，6；i＝1,2，3，4，計算豎直方向上c1和c3、c1和c5、c3和c5、c2和c4、c2和c6、c4和c6的相對偏轉角度并記為α4、α5、α6、α7、α8、α9，分別取其平均值，即α_x＝(α1+α2+α3)/3，α_y＝(α4+α5+α6+α7+α8+α9)/6，α_x和α_y即為圖片O₁在水平方向和豎直方向上的偏轉角度，取α＝(α_x+α_y)/2，則α即為O₁的偏轉角度，根據Y_c1-Y_c2與零的關系確定O₁的偏轉方向，從而將O₁按順時針或逆時針方向旋轉角度α，得到新的圖片，重新記為O₁，其大小記為N”*M”；

步驟7：重復步驟5，得到新圖片O₁上六個標記的中心坐標，重新記為c1(X_c1，Y_c1)，c2(X_c2，Y_c2)，c3(X_c3，Y_c3)，c4(X_c4，Y_c4)，c5(X_c5，Y_c5)，c6(X_c6，Y_c6)，并轉至步驟8；

步驟8：裁剪掉O₁上由ci所構成的矩形區域G以外的部分，i＝1,2，……，6，并將G以內的部分放大或縮小，得到新的圖片記為OO，使OO的尺寸與步驟1中所述dPCR芯片同一部分的尺寸相同，為(N-2a)*(N-2a)；

步驟9：以dPCR芯片上十字標記P1的中心坐標作為基點坐標，記為(0,0)，第i個微反應腔的圓心為中心坐標，作直徑為d的圓，記為圓CE_i，i＝1,2，……，n-1，n，n為微反應腔的總數目，圓CE_i的位置即為圖片OO上第i個微反應腔的位置，將圓CE_i內包括邊緣所有點的值設置為i，其余值均設置為0，建立(N-2a)*(N-2a)的矩陣B，設矩陣B中數據i的位置為b1行b2列，則提取圖片OO中b1行b2列的數據f_y，取f_y的平均值并記為Fi，Fi即為dPCR芯片上第i個微反應腔的熒光強度，統計相同Fi的個數并記為Numi,從而得到實驗結果，實驗結果由熒光強度Fi及其個數Numi表示。