[發明專利]黃芪多糖在環介導等溫擴增中的應用及其試劑盒和檢測方法

在審

• 申請號: 201710786135.9
• 申請日: 2017-09-04
• 公開（公告）號: CN107435075A
• 公開（公告）日: 2017-12-05
• 發明（設計）人: 楊金龍;殷素會;戴茜茜;許國洋;周嬋;王海燕;谷山林;王介平;呂金鳳;王小燕;李晉
• 申請（專利權）人: 重慶市畜牧科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司11275
• 代理人: 趙榮之

1.黃芪多糖在環介導等溫擴增中降低聚合酶使用量或/和縮短反應時間中的應用。

2.含有黃芪多糖的環介導等溫擴增的檢測試劑盒，其特征在于，包括如下組分：環介導等溫擴增內引物和外引物，嗜熱乳酸枯草芽孢桿菌DNA聚合酶、10×熱聚合反應緩沖液、三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物、硫酸鎂、甜菜堿、黃芪多糖和熒光染料賽博綠Ⅰ；所述10×熱聚合反應緩沖液由濃度為150-250mmol/L、pH為8.5-8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、濃度為50-100mmol/L的氯化鉀、濃度為50-100mmol/L的硫酸銨、濃度為15-20mmol/L的硫酸鎂和質量分數為0.5-1％的曲拉通X-100組成；所述三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物由三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸組成；所述環介導等溫擴增內引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述外引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

3.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述環介導等溫擴增內引物濃度分別為5μmol/L；所述外引物濃度分別為20μmol/L。

4.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述嗜熱乳酸枯草芽孢桿菌DNA聚合酶濃度為4U/μl、所述三磷酸堿基脫氧核苷酸混合物各組分濃度為10mmol/L、硫酸鎂濃度為100mmol/L、甜菜堿濃度為2mol/L、黃芪多糖濃度為4mol/L和熒光染料賽博綠Ⅰ質量分數為10％。

5.根據權利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述10×熱聚合反應緩沖液由濃度為250mmol/L、pH為8.8的Tris–HCl、濃度為100mmol/L的氯化鉀、濃度為100mmol/L的硫酸銨、濃度為20mmol/L的硫酸鎂和質量分數為1％的Triton X-100組成。

6.權利要求2～5任一項所述的試劑盒在基于環介導等溫擴增檢測雞鼻炎副雞嗜血桿菌中的應用。

7.基于環介導等溫擴增檢測雞鼻炎副雞嗜血桿菌的方法，其特征在于：包括以下步驟：

a、提取待檢樣品的細菌DNA作為模板DNA，控制模板DNA水溶液的OD₂₆₀/OD₂₈₀值為1.6～2.0，濃度為10～100ng/μl；

b、雞鼻炎副雞嗜血桿菌的環介導等溫擴增：在反應管中配制環介導等溫擴增反應體系，各組分終濃度如下：濃度各為0.1-0.2μmol/L的內引物，濃度各為0.5-0.8μmol/L的外引物，3～4U嗜熱乳酸枯草芽孢桿菌DNA聚合酶，1×熱聚合反應緩沖液，濃度各為0.5-1mmol/L的三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸、三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸和三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸，濃度為2-3mmol/L的硫酸鎂，濃度為0.5-1mol/L的甜菜堿，濃度為0.1～0.5mol/L的黃芪多糖，待檢模板DNA水溶液0.5-1μl，余量為水；將反應管于60～65℃水浴中保溫反應20～30分鐘，再于80～95℃水浴中保溫3～5分鐘終止反應；所述內引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述外引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；

c、顯色檢測：在反應管中加入質量分數為10％的熒光染料賽博綠Ⅰ水溶液0.5-1μl，用肉眼觀察顏色變化，如果顏色為黃色，說明待檢樣品中不含有雞鼻炎副雞嗜血桿菌；如果顏色變為綠色，說明待檢樣品中含有雞鼻炎副雞嗜血桿菌。