[發明專利]一種海藻糖合酶突變體及其在制備海藻糖中的應用

有效

• 申請號: 201710776847.2
• 申請日: 2015-04-28
• 公開（公告）號: CN107384903B
• 公開（公告）日: 2019-05-17
• 發明（設計）人: 吳敬;謝艷萍
• 申請（專利權）人: 湖南匯升生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/90
• 分類號: C12N9/90;C12N15/70;C12P19/12
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種海藻糖合酶突變體及其在制備海藻糖中的應用，屬于基因工程和酶工程領域。本發明將Thermobifida fusca YX的海藻糖合酶活性中心附近第289位的谷氨酸突變成甘氨酸得到突變體E289G；將第295位的組氨酸突變成天冬酰胺突變體H295N；將第344位的甲硫氨酸突變成賴氨酸突變體M344K；將第367位的甲硫氨酸突變成亮氨酸突變體M367L，并在H295N基礎上進行雙突變得到突變體H295N/E289G、H295N/M344K、H295N/M367L、H295N/M344K/M367L。突變體實現了底物中即使含有一定的葡萄糖，海藻糖合酶制備海藻糖的轉化效率依然不會受到很大的影響，具有較高的工業價值。

本申請是申請號為：201510210023.X，申請日為：2015年4月28日，申請名稱為：一種海藻糖合酶的突變體及其制備方法和應用的分案申請。

技術領域

本發明涉及一種海藻糖合酶突變體及其在制備海藻糖中的應用，屬于基因工程和酶工程領域。

背景技術

海藻糖是一種安全無毒以1,1-糖苷鍵構成的非還原性二糖，有三種異構體即(α,α)、異海藻糖(β,β)、新海藻糖(α,β)，一般以二水化合物的形式存在。與蛋白質或者氨基酸共同加熱，不會產生美拉德反應，并且在酸性、堿性、高溫、超低溫環境都能保持一定的穩定性。其獨特的生物活性，使得海藻糖得到廣泛的應用。大量的研究表明，海藻糖是單細胞生物、動物組織和器官、蛋白質、生物膜、醫藥制劑等的保護劑，能夠抑制脂質酸化、淀粉老化、蛋白質變性，具有矯味矯臭功能、搞玻璃轉化溫度、低吸濕性、低甜度等性質，能夠將其應用到醫藥業、農業、生化制品業、化妝品行業、食品加工業。

早期商業化的海藻糖是從酵母中提取的。1990年價格約700美元/kg，提取率過低，成本過高。1995年日本利用雙酶法實現工業化生產，使得海藻糖價格由原來的2萬日元/kg大幅降到1997年的280日元/kg。中國2002年首次以雙酶法實現海藻糖的產業化，價格79元/kg。雙酶法以淀粉為原料，在麥芽寡糖基海藻糖水解酶和麥芽寡糖基海藻糖合成酶的作用下生成海藻糖，此法生產工藝復雜，難以推廣，目前全世界只有幾個公司能生產。而海藻糖合酶以麥芽糖為底物，一步轉化生成海藻糖，是相對經濟的生產方法，但仍有很多問題需要研究解決，其中海藻糖合酶是關鍵。因此，挖掘適合生產海藻糖的海藻糖合酶對于推動海藻糖的大規模工業化、降低產業成本具有重大的意義。

麥芽糖可以通過水解淀粉得到，生產過程中會產生一定的葡萄糖，工業化生產海藻糖使用純的麥芽糖成本過高。海藻糖合酶除了轉苷作用外還有微弱的水解反應，由此生成副產物葡萄糖。本發明所使用的來源于Thermobifida fusca YX海藻糖合酶若以工業級的麥芽糖(含有1％-10％的葡萄糖)為底物，海藻糖合酶酶轉化率會受到一定的影響。本發明通過定點突變對海藻糖合酶進行改造，削弱葡萄糖對酶轉化的抑制作用。

發明內容

本發明所要解決的一個技術問題是提供一種海藻糖合酶的突變體，其活性中心位點附近氨基酸發生突變，得到受葡萄糖抑制影響減弱的海藻糖合酶。所述突變體包括含有一個、兩個或三個相對于Thermobifida fusca YX海藻糖合酶活性氨基酸殘基的取代。

所述海藻糖合酶的親本的氨基酸序列與NCBI數據庫中的Thermobifida fusca YX海藻糖合酶一致(登錄號WP_011291031.1)。

所述突變體是將親本海藻糖合酶的第289位的谷氨酸(Glu)突變為甘氨酸(Gly)，命名為E289G；或將第295位的組氨酸(His)突變成天冬酰胺(Asn)，所得突變體命名為H295N；或將第344位的甲硫氨酸(Met)突變成賴氨酸(Lys)，所得突變體命名為M344K；或將第367位的甲硫氨酸(Met)突變成亮氨酸(Leu)，所得突變體命名為M367L。