[發(fā)明專利]玉米籽粒類胡蘿卜素缺陷基因SCD的克隆及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710728636.1
• 申請日: 2017-08-23
• 公開（公告）號: CN107418971B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊小紅;張麗麗;李建生;張義榮
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C07K14/415;A01H5/10;A01H5/12;A01H6/46;C12N9/22
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢

本發(fā)明公開了玉米籽粒類胡蘿卜素缺陷基因SCD的克隆及應(yīng)用。本發(fā)明公開的SCD基因編碼如下的蛋白質(zhì)：A1)氨基酸序列是序列表中序列1的蛋白質(zhì)；A2)氨基酸序列是序列表中序列4的蛋白質(zhì)；A3)將序列表中序列1或序列4所示的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)證明，SCD基因及其編碼的蛋白質(zhì)與玉米白化相關(guān)，可用于調(diào)控玉米植株、葉片和籽粒顏色，也可用于構(gòu)建玉米白化模型，可用于植物基因工程、基因編輯技術(shù)及分子育種中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物分子遺傳學(xué)和植物基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及玉米籽粒類胡蘿卜素缺陷基因SCD的克隆及功能驗(yàn)證。該基因可用于植物基因工程、基因編輯技術(shù)及分子育種中。

背景技術(shù)

玉米是重要的糧飼兼用型作物，同時(shí)也是研究植物遺傳和基因功能的重要模式植物。玉米的種植面積和總產(chǎn)已超過水稻成為我國最重要的作物，因此確保玉米的穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)對保證我國糧食安全具有重要的意義。優(yōu)良的玉米雜交種是影響玉米產(chǎn)量的重要因素之一。但在實(shí)際生產(chǎn)中，玉米雜交種還存在很多不足之處，例如有些品種不抗病蟲害、易倒伏、產(chǎn)量低等，需要進(jìn)行遺傳改良。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因、基因編輯等技術(shù)將是作物遺傳改良的主要方法。這兩種技術(shù)都離不開高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

自1996年第一例轉(zhuǎn)基因作物被批準(zhǔn)商業(yè)化生產(chǎn)以來，轉(zhuǎn)基因作物的研發(fā)與生產(chǎn)得到了迅猛發(fā)展，全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積從1996年的170萬公頃增加到2016年的1.851億公頃。其中，玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究始于1986年，到2016年全球單個作物種植面積中轉(zhuǎn)基因玉米的應(yīng)用率是26％。孟山都、先鋒、先正達(dá)等國外大公司建立了工廠化流水線式的規(guī)?；南鄬Τ墒斓挠衩邹D(zhuǎn)基因技術(shù)體系，國外公立機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室也實(shí)現(xiàn)了較高遺傳轉(zhuǎn)化效率玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。中國玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系研究起步較晚，目前初步建立了玉米規(guī)?；D(zhuǎn)基因技術(shù)體系，但仍有必要進(jìn)一步提高玉米遺傳轉(zhuǎn)化效率，同時(shí)應(yīng)緊跟玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)展趨勢，大力發(fā)展多基因轉(zhuǎn)化技術(shù)、基因打靶技術(shù)及安全轉(zhuǎn)化技術(shù)，使轉(zhuǎn)基因玉米技術(shù)體系更好服務(wù)于玉米基因功能研究、有應(yīng)用價(jià)值轉(zhuǎn)基因玉米新材料產(chǎn)品研發(fā)和品種培育等。

盡管玉米規(guī)模化轉(zhuǎn)基因體系已初成規(guī)模，但玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系也仍存在許多不足需要完善。首先，基因轉(zhuǎn)化效率低。盡管近些年農(nóng)桿菌和基因槍等轉(zhuǎn)化方法從多方面都有所提高和優(yōu)化，但整體而言，玉米基因轉(zhuǎn)化效率相對于水稻、擬南芥等仍然很低。其次，可用于轉(zhuǎn)基因的玉米受體材料有限，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的玉米遺傳轉(zhuǎn)化受玉米基因型限制，它需要用于遺傳轉(zhuǎn)化的玉米受體材料具有很好的組培特性。目前國際上常用玉米雜交種HiII、玉米自交系B73及中國玉米優(yōu)良自交系綜31等為轉(zhuǎn)化受體，這限制了轉(zhuǎn)化方法在多種基因型應(yīng)用的普及。除此之外，農(nóng)桿菌侵染方法以及農(nóng)桿菌與玉米幼胚共培養(yǎng)后對轉(zhuǎn)化細(xì)胞的篩選所需要的選擇壓等一系列技術(shù)細(xì)節(jié)，都需要進(jìn)一步的優(yōu)化，來提高轉(zhuǎn)化效率。在開發(fā)新的轉(zhuǎn)化方法和優(yōu)化已有的轉(zhuǎn)化技術(shù)的過程中，需要易觀察轉(zhuǎn)化效率的標(biāo)記基因，即在再生苗階段就可以直接評價(jià)基因轉(zhuǎn)化方法的優(yōu)劣和轉(zhuǎn)化效率的高低，而不依賴于分子特征的檢測。

基因編輯技術(shù)產(chǎn)生于20世紀(jì)80年代，是一種利用工程核酸酶在體內(nèi)精準(zhǔn)編輯基因組的技術(shù)。目前應(yīng)用最廣的三類特異的工程核酸酶有鋅指核酸酶(ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活子內(nèi)效應(yīng)子核酸酶(TALEN)和規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)序列及其核酸酶(CRISPR/Cas9)。這三種技術(shù)，尤其是CRISPR/CAS9介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)，已經(jīng)開始在植物基因功能驗(yàn)證和遺傳改良方面得到應(yīng)用，但仍然存在一系列的問題需要改進(jìn)。ZEN是最早被利用，但特異性低、效率不高、脫靶率大，并且操作繁瑣、成本高。TALEN技術(shù)可以像ZEN一樣完成對基因組的編輯，且相對簡單費(fèi)用低。相對于前兩種方法，最新的編輯技術(shù)CRISPR/Cas9技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢，它的載體構(gòu)建簡單、成本更低，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)的定點(diǎn)修飾、靶向效率更高。但自CRISPR/Cas9技術(shù)投入使用至今，研究者們?nèi)砸恢痹谔剿魈岣咴摷夹g(shù)靶向效率的方法，如通過提高sgRNA的特異性、改造Cas9蛋白的結(jié)構(gòu)降低脫靶效應(yīng)以及選擇構(gòu)建合適的載體等。在這些方法的摸索過程中，同樣需要在苗期就可以評價(jià)相應(yīng)的突變效率的靶基因。

發(fā)明內(nèi)容