[發明專利]用于抗咪草煙除草劑基因型檢測的功能標記AS?ALS及其應用

在審

• 申請號: 201710697825.7
• 申請日: 2017-08-15
• 公開（公告）號: CN107267656A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發明（設計）人: 楊杰;王芳權;范方軍;王軍;李文奇;許揚;仲維功;楊睿
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司32200
• 代理人: 張素卿

技術領域

本發明屬于農業生物工程領域，涉及用于抗咪草煙除草劑基因型檢測的功能標記AS-ALS及其應用。

背景技術

水稻是全世界近一半人口的主糧，也是我國主要的糧食作物之一。水稻傳統的栽培方式以人工栽種為主，費時費力，隨著人力成本的提高，水稻栽培成本也大幅提高，效益低下。近年來，隨著我國新型城鎮化和現代農業的發展，水稻生產正在向集約化、規模化、機械化發展，機插秧、直播等輕簡栽培已成為發展趨勢。然而，直播稻田容易滋生雜草及雜草稻，嚴重影響水稻生長、產量及稻谷品質。人工除草的成本極高，制約了水稻生產朝著高產、高效、低成本方向發展，不利于發展現代農業。因此，開展抗除草劑的水稻育種和應用對于水稻優質、高效生產有著重要的意義。

咪唑啉酮類除草劑是由美國氰胺公司開發成功的一類高效廣譜低毒的除草劑，目前已經有6種商品化，包括：咪唑煙酸、咪唑乙煙酸、咪草酸、咪唑喹啉酸、甲氧咪草煙和甲基咪草煙。其中咪唑乙煙酸，又稱為咪草煙，是一種常用于大豆田的高效除草劑，能有效防除一年生禾本科雜草和闊葉雜草(石磊.農藥市場信息,2003,7:16.)。咪草煙的作用機理是通過抑制乙酰乳酸合成酶(Acetolactate Synthase，ALS)，從而抑制側鏈氨基酸的合成(Gaston S,etal.Physiologia plantarum,2002,114(4):524-532.)。

本發明人所在團隊擬現有水稻品種資源材料中篩選抗咪草煙的水稻材料。找到抗咪草煙的水稻材料ALS基因序列突變位點，開發抗咪草煙的水稻材料ALS基因分子標記。

該基因可以通過回交轉育到栽培品種中，但傳統上需要進行噴施除草劑逐代篩選鑒定，其過程經歷多代的雜交和回交，育種周期長，而且該基因為顯性基因，表型選擇難以剔除雜合基因型，更加大了育種周期和難度。因此，利用分子標記輔助選擇(Marker-Assisted Selection,MAS)技術，進行基因型篩選鑒定，加快雜交后代的早代穩定，對于抗除草劑基因快速轉育、加快育種進程具有重要意義。本發明根據該位點的突變，設計了等位基因特異PCR標記，進行基因型選擇，加快早代穩定，建立了抗除草劑分子育種技術體系。

發明內容

技術問題

本發明的目的是針對將抗除草劑基因檢測過程繁瑣的問題，提供一個用于檢測樣品中攜帶抗除草劑或感除草劑基因的分子標記AS-ALS；

本發明的另一目的是提供了一種AS-ALS標記用于檢測水稻品種中含有抗除草劑或感除草劑基因的檢測方法；

本發明的又一目的是提供了一種AS-ALS標記用于檢測雜交后代抗除草劑或感除草劑基因的攜帶情況，利于分子標記輔助選育抗除草劑新品系。

技術方案

本發明提供了一種用于抗咪草煙除草劑基因型檢測的功能標記AS-ALS，所述抗咪草煙除草劑基因型為ALS基因編碼區第1880位堿基G轉換為A的突變，一種能夠通過兩個PCR檢測，明確ALS基因第1880位堿基為G(感咪草煙)，還是為A(抗咪草煙)的鑒定方法，從而能夠快速篩選樣品中是攜帶抗咪草煙，還是攜帶感咪草煙的基因型。本發明的準確性高、操作簡單、檢測效率高、成本低廉，具有很強的實用價值。

具體而言，本發明根據水稻ALS基因第1880位堿基的功能突變位點，設計的功能標記AS-ALS包含兩個引物組合：F1N和F1M；

其中所述的F1N引物組合包含上下游兩個引物：AS-ALS-F1與AS-ALSn-R2-2，所述的F1M引物組合包含上下游兩個引物：AS-ALS-F1與AS-ALSm-R2-1：

所述的AS-ALS-F1序列：5’-GAGGCAATCATCGCTACTGG-3’，

所述的AS-ALSn-R2-2序列：5’-TGTCCTTGAATGCGCCCCTAC-3’，

所述的AS-ALSm-R2-1序列：5’-TGTCCTTGAATGCGCCCCTAT-3’

含有感咪草煙ALS-G基因型的樣品能被F1N引物組合擴增出547bp條帶，含有抗咪草煙ALS-A基因型的樣品能被F1M引物組合擴增出547bp條帶，同時含有ALS-G和ALS-A基因型的樣品能同時被F1N和F1M兩種引物組合擴增出547bp條帶。