[發明專利]一株大腸埃希氏菌JL?HYP及其在生產羥脯氨酸中的應用

在審

• 申請號: 201710688303.0
• 申請日: 2017-08-12
• 公開（公告）號: CN107435035A
• 公開（公告）日: 2017-12-05
• 發明（設計）人: 劉帥;王衛富;謝沛;劉曉東;劉小都;李靜
• 申請（專利權）人: 河南宏大生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P13/24;C12R1/19
• 代理公司: 洛陽公信知識產權事務所(普通合伙)41120
• 代理人: 程茗

本發明涉及一種大腸埃希氏菌JL?HYP及其在生產羥脯氨酸中的應用；所述大腸埃希氏菌JL?HYP，分類命名為大腸埃希氏菌（Escherichia coli），菌種保藏編號為CGMCC NO.13922。大腸埃希氏菌JL?HYP菌株經斜面活化，再經梯度稀釋，涂布于LB培養基上，培養后，挑取單個菌落分別接種到LB斜面培養基上，置于生化培養箱30?36℃培養12h；從LB斜面培養基上挑取單個菌落接種到裝有種子培養基的種子瓶中培養；將種子液接種到裝有發酵培養基的發酵罐中進行培養30?45h，得到含有羥脯氨酸的發酵液，然后提取發酵液中的羥脯氨酸。該菌株發酵周期短，菌體密度高，用于制備羥脯氨酸產量和得率高。

技術領域

本發明涉及一株大腸埃希氏菌，具體的說是一種大腸埃希氏菌JL-HYP及其在生產羥脯氨酸中的應用。

背景技術

羥脯氨酸(Hydroxyproline，Hyp)為亞氨基酸，全名為，順式-4-羥基-L-脯氨酸;是L-脯氨酸羥基化后的產物，其分子式為C₅H₉NO₃。羥脯氨酸呈白色片狀結晶或結晶性粉末，微甜，熔點為274℃，易溶于水，微溶于乙醇。

目前，國內外報道的生產羥脯氨酸的方法主要有蛋白水解提取法、化學合成法、微生物發酵法和酶促轉化法四種，其中蛋白水解提取法是目前普遍采用的工業生產方法。但是，蛋白水解提取法需經過強酸強堿處理，純化步驟長，而且羥脯氨酸提取率在4％-7％，提取和原料成本高，不僅浪費大量原料，而且廢棄物污染嚴重，隨著目前環境壓力的增加和資源原料價格的上升，傳統的蛋白水解提取法正逐漸被市場淘汰。微生物發酵法正以其綠色環保的工藝、原料和成本低廉的優勢迅速發展起來。

微生物發酵法生產羥脯氨酸的研究還處于實驗室階段，尚未形成成熟的工業化生產工藝，而先進的工業化生產工藝，尤其是菌種的固體培養配方及方法對于羥脯氨酸的發酵單位、成本和三廢排放有重要影響。福建師范大學黃建忠等人利用大腸桿菌HYP035(Escherichia#coli.HYP035)生產羥脯氨酸,其發酵液中羥脯氨酸產量為45g/L，脯氨酸的轉化率達到85％,發酵周期為40h。江南大學張震宇等人利用重組大腸桿菌發酵生產羥脯氨酸,通過利用脯氨酸-4-羥化酶基因和色氨酸啟動子序列,先優化設計色氨酸串聯啟動子和脯氨酸-4-羥化酶結構基因,然后全基因合成色氨酸串聯啟動子基因和脯氨酸-4-羥化酶結構基因后,將啟動子和結構基因連接到pAMP質粒上,構建了可過量表達脯氨酸-4-羥化酶的重組質粒pAMP-P2trp-Hyp,將該重組質粒導入大腸桿菌，構建出重組大腸桿菌；搖瓶發酵結果表明,該重組大腸桿菌的羥脯氨酸的產量達到0.31g/L。

發明內容

本發明目的是為解決上述技術問題的不足，提供一種大腸埃希氏菌JL-HYP及其在生產羥脯氨酸中的應用，該菌株發酵周期短，菌體密度高，用于制備羥脯氨酸產量和得率高。

一株大腸埃希氏菌JL-HYP，分類命名為大腸埃希氏菌（Escherichia coli），已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC），菌種保藏編號為CGMCCNO.13922，保藏日期為2017年3月23日。

所述大腸埃希氏菌JL-HYP可應用于制備羥脯氨酸，可進行活化和擴大培養后，接種到發酵罐中進行發酵制取羥脯氨酸。

采用大腸埃希氏菌JL-HYP制備羥脯氨酸，包括以下步驟：

步驟一、大腸埃希氏菌JL-HYP菌株經斜面活化，生化培養箱37℃培養20h，再經梯度稀釋，涂布于LB培養基上，培養后，挑取單個菌落分別接種到LB斜面培養基上，置于生化培養箱30-36℃培養12h；從LB斜面培養基上挑取單個菌落接種到裝有種子培養基的種子瓶中培養，培養條件：溫度30-36℃、搖床轉速200rmp、培養時間6-8 h；當OD值長到1.0-2.0時，得到種子液，備用；