[發明專利]基于二氧化鈦修飾多孔硅在線富集和檢測S層蛋白的生物芯片傳感器及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201710654945.9
• 申請日: 2017-08-03
• 公開（公告）號: CN107290546A
• 公開（公告）日: 2017-10-24
• 發明（設計）人: 李建林;荀明月;潘道東;鄭鐵松;李瑋;金巖昊;李奕辰;李亞維;劉妍;丁志;鄧楊;朱瑞雪;蔡婷婷
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙)32204
• 代理人: 孫斌

技術領域

本發明屬于生物檢測，具體涉及一種基于二氧化鈦修飾多孔硅在線富集和檢測嗜酸乳桿菌S層蛋白的生物芯片傳感器及其制備方法和應用。

背景技術

S-層蛋白是存在于細胞膜或細胞壁外的一種表層蛋白，是一類由蛋白質亞基組成的單層晶體結構，有多種乳酸菌表面存在S-層蛋白。嗜酸乳桿菌是黏附于腸道內的一種功能性益生菌，其表面的S-層蛋白在黏附中起到重要作用，對嗜酸乳桿菌發揮益生功能有重要貢獻；S-層蛋白可以和腸上皮細胞表面的受體結合，阻斷致病菌與病毒與其結合，因此對致病菌與病毒有一定抑制作用。對S- 層蛋白進行快速、有效的富集和檢測可推進其進一步的研究。目前對S-層蛋白的檢測技術主要有質譜技術、氨基酸組分分析技術等，這些方法成本較高且操作復雜。因此開發一種操作簡便、準確快速且高效的富集和檢測方法十分重要。

多孔硅是使用單晶硅制備得到的具有海綿狀結構的材料，多孔硅的光學特性使之在傳感器方面具有很大應有價值，主要表現在其具有良好的反射性能，因此傳感器可以基于這一點進行光信號的檢測；另外由于多孔硅有其他許多不可多得的優點，如具有極大的比表面積、可在室溫下發射可見光、化學穩定性良好、具有良好的生物兼容性等，也使其在傳感器方面受到了廣泛的研究應用。但是現有的孔硅非標記檢測技術的穩定性差對復雜樣品中S層蛋白不能進行特異性富集和檢測，且沒有報道。

發明內容

發明目的：針對現有技術存在的缺陷，如本發明所述的一種基于二氧化鈦修飾多孔硅在線富集和檢測S層蛋白的生物芯片傳感器，該生物芯片傳感器可以有效地、高選擇性地富集和檢測S-層蛋白。

本發明還提供基于二氧化鈦修飾多孔硅在線富集和檢測S層蛋白的生物芯片傳感器的制備方法和應用。

技術方案：為了實現上述目的，如本發明所述一種基于二氧化鈦修飾多孔硅在線富集和檢測S層蛋白的生物芯片傳感器，由二氧化鈦修飾的多孔硅為載體，通過微流控技術結合，利用A蛋白將S-層蛋白單克隆抗體定向固定于二氧化鈦修飾的多孔硅表面制備得到。

本發明所述的生物芯片傳感器的制備方法，包括以下步驟：

(1)多孔硅的制備：采用陽極氧化法將硅片制備得到多孔硅，并進行高溫氧化處理；

(2)二氧化鈦修飾多孔硅：將鈦酸四丁酯、無水乙醇、三乙醇胺混合均勻，用旋涂法將其涂布于步驟(1)所得的多孔硅表面，接著對多孔硅進行高溫氧化處理，該步驟重復2-3次；

(3)抗體的固定：將步驟(2)所得二氧化鈦修飾的多孔硅固定于微流控裝置，勻速泵入A蛋白溶液使其非共價吸附于多孔硅表面，接著泵入S-層蛋白單克隆抗體溶液，使其被A蛋白捕獲，通過A蛋白定向固定抗體的方法將S-層蛋白單克隆抗體固定于二氧化鈦修飾的多孔硅表面，得到生物芯片傳感器。

其中，步驟(2)所述的鈦酸四丁酯、無水乙醇、三乙醇胺體積比5-6:30:1-2。優選體積比為5:30:1。

進一步地，步驟(2)所述的鈦酸四丁酯、無水乙醇、三乙醇胺的混合溶液按質量體積比100-120：50(ul/mg)滴在多孔硅表面。作為優選，混合溶液按質量體積比100：50(ul/mg)按片滴在多孔硅表面。

其中，步驟(3)所述微流控裝置由樣品池和恒流泵構成；二氧化鈦修飾的多孔硅固定于樣品池底部使液體流經多孔硅表面，由恒流泵提供穩定的流速。恒流泵一端連接裝樣品的離心管，另一端連接樣品池，這樣可使樣品循環流動經過多孔硅表面，便于蛋白的粘附和檢測。使用光纖光譜儀檢測多孔硅表面的干涉反射峰，保持光源固定檢測多孔硅表面一點，以免光源移動使檢測結果產生誤差。微流控裝置的樣品池材料為聚甲基丙烯酸甲酯，厚度8mm，寬度30mm，長度 60mm，中間孔徑1.5mm，孔徑總成長80mm，進出槽孔徑由管徑1.4mm不銹鋼管連接，不銹鋼管連接內孔徑1.3mm，管壁后1.6mm的硅膠管，樣品槽直徑 5.0mm，光纖垂直多孔硅表面檢測。所述生物芯片傳感器由微流控裝置和固定 S-層蛋白單克隆抗體固定于二氧化鈦修飾的多孔硅構成。

步驟(3)所述A蛋白溶液濃度為0.1-0.2mg/mL；S-層蛋白單克隆抗體溶液濃度為50-55μg/mL。作為優選，A蛋白溶液濃度為0.1mg/mL；S-層蛋白單克隆抗體溶液濃度為50μg/mL。

本發明所述的生物芯片傳感器在線富集和檢測S層蛋白中的應用。

進一步地，所述生物芯片傳感器在線富集和檢測嗜酸乳桿菌中S層蛋白。