[發明專利]一種生產無巖藻糖基化蛋白的基因工程細胞系及其建立方法

有效

• 申請號: 201710641279.5
• 申請日: 2017-07-31
• 公開（公告）號: CN107217042B
• 公開（公告）日: 2020-03-06
• 發明（設計）人: 魏化偉;黃亞杰
• 申請（專利權）人: 江蘇東抗生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12P21/00;C12R1/91
• 代理公司: 北京預立生科知識產權代理有限公司 11736
• 代理人: 李紅偉;高倩倩

本發明公開了一種生產無巖藻糖化蛋白的基因工程細胞系及其建立方法。本發明通過利用CRISPR/Cas9技術敲除宿主細胞中的Slc35c1基因、和/或Fut8基因，獲得Slc35c1基因沉默、和/或Fut8基因沉默的穩定基因工程細胞系。利用本發明的基因工程細胞系可以生產完全去除巖藻糖化的蛋白，并且傳30代次后依然穩定，解決了現有技術中巖藻糖化去除不完全和傳代不穩定的兩大問題。通過本發明的方法生產出的無巖藻糖化的抗體表現出增強的ADCC活性從而增強了抗體臨床治療效果。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，涉及一種可以生產無巖藻糖基化蛋白的基因工程細胞系及其建立方法。

技術背景

自從1986年批準第一個抗體藥物以來，抗體類藥物已經過30多年的蓬勃發展，由于抗體藥物具有高度的靶向性、特異性、專一性等明顯優勢，治療領域也從傳統的癌癥、自身免疫性疾病逐步擴展到抗感染、代謝性疾病以及心血管疾病的診治方面等，并取得了矚目的療效，在其改善患者生存質量的同時，也創造了巨大的經濟效益。針對腫瘤的抗體除了阻斷靶點介導的信號轉導從而誘導細胞凋亡外，更多的治療性抗體通過以下效應功能發揮治療作用：細胞依賴的細胞毒性作用(antibody-dependent cell-mediatedcytotoxicity，ADCC)、細胞依賴的吞噬作用(antibody-dependent cellularphagocytosis，ADCP)、補體依賴的細胞毒性作用(complement-dependent cytotoxicity，CDC)等。

細胞依賴的細胞毒性作用(ADCC)是指表達抗體Fc受體(如FcγRIIIa)的自然殺傷細胞(NK)、巨噬細胞或中性粒細胞等，通過Fc受體與已結合在靶細胞表面的IgG抗體的Fc段結合，進而活化，釋放穿孔素、顆粒酶等細胞毒物質直接殺傷靶細胞的作用。ADCC是治療性抗體臨床療效的關鍵機制之一，對于抗體發揮療效至關重要，這一點也得到了臨床研究的支持。抗體與Fc受體(如FcγRIIIa)的結合情況直接影響抗體的ADCC效應功能，可以通過改變抗體Fc段的蛋白結構或是Fc段的寡糖鏈修飾以增強抗體與Fc受體(如FcγRIIIa)的結合能力，進而增強ADCC效應，增強抗體臨床治療效果。增強治療性抗體的效應功能不僅能夠獲得更好的治療效果，同時可以減少治療所需抗體用量從而降低治療成本。

近年來，研究發現去除或降低巖藻糖基化后，治療性抗體在動物體內或臨床表現出更好的療效。主要是由于去除或降低巖藻糖基化的抗體提高與FcγRIIIa親和力，可以在更低濃度下通過與FcγRIIIa的高親和力而表現出較強的ADCC作用，去除或降低巖藻糖基化成為提高下一代治療性抗體效能的有效方法之一。因此，研究出能生產無巖藻糖基化抗體的工程細胞株是本領域的技術人員急待解決的問題。

但目前大多數單克隆抗體都是由中國倉鼠卵巢細胞(CHO)細胞制備的，這類抗體的核心巖藻糖基化水平很高，如何去除抗體Fc區的核心巖藻糖提高其ADCC效應是目前此類抗體研究的主要熱點之一。其中，于2013年被批準上市的Gazyva(Obinutuzumab)，是獲批上市的糖工程化單克隆抗體，其巖藻糖敲除是基于羅氏的GlycoMab^TM技術平臺，通過高表達β-1,4-N乙酰葡萄糖胺基-轉移酶III(GnTIII酶)，促進N-糖末端平分型半乳糖苷的加入，進而抑制抗體核心巖藻糖修飾，進一步增強了抗體的ADCC活性。但是該糖基化改造技術存在一定的缺陷：該技術通過引入平分型半乳糖苷，使得抗體上的糖型多達30種以上，其種類更多、更為復雜化，增加了糖型的異質性和產品的質量控制難度；此外該方法的巖藻糖去除效率低，仍有約30％的糖型含有核心巖藻糖。

本申請通過對Slc35c1和Fut8兩個基因同時敲除能夠完全去除蛋白的巖藻糖基化，并且傳30代次后仍無法檢測到巖藻糖基化的蛋白，解決了巖藻糖基化去除不完全和傳代不穩定的兩大問題。

發明內容