[發明專利]穩定高效表達重組人BMP7的CHO細胞株及醫用用途

有效

• 申請號: 201710620918.X
• 申請日: 2017-07-27
• 公開（公告）號: CN107164333B
• 公開（公告）日: 2021-04-02
• 發明（設計）人: 劉暢;郭鳳祥;于愛東;宋昊;韓順子;唐劍光;劉涵;周利微;關詩宇;于虹;常東英;吳曉娟;遲春萍;曹玉鋒;時成波;李利;劉照惠
• 申請（專利權）人: 長春生物制品研究所有限責任公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/12;C12N15/85;C12P21/00;C12R1/91
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 陳宏偉

本發明提供一種穩定高效表達重組人BMP7的CHO細胞株及醫用用途，采用改造鼠bmp7基因的方式構建bmp7基因序列，作為宿主的CHO細胞同樣來源于鼠，其基因相容性和翻譯效率大大提高，克服了利用CHO系統表達的BMP7蛋白的基因序列模板均來自人bmp7基因的現有技術存在的缺欠，避免了CHO細胞由于密碼子偏好性難以高效轉錄和翻譯人源基因序列；同時，本發明所采用的CHO?S細胞是已經適應了無血清培養基的懸浮培養細胞，無需進行細胞株的懸浮馴化，有助于保持工程CHO細胞株的穩定性。本發明采用的技術手段對于BMP表達中以下關鍵性步驟：轉錄、翻譯、折疊、前提切割、分泌、二硫鍵的配對和糖基化位點的糖型修飾，有明顯效率提高的作用。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，提供了一株整合了經改造的鼠bmp7基因的CHO細胞株，為一種穩定高效表達重組人BMP7的CHO細胞株，同時還公開了其醫用用途。

背景技術

骨形態發生蛋白（Bone Morphogenetic Protein，BMPs）是一類低種屬特異性的蛋白質生長因子，具有多個亞型。BMPs能夠誘導間充質細胞不可逆的分化為軟骨和骨細胞。骨形態發生蛋白-7又稱成骨蛋白-1（Osteogenic Protein-1，OP-1），在胚胎時期參與細胞的增殖、分化，調控腎、腸、骨等多種器官的形成和發育。成人BMP7主要在骨、腎組織中表達，特別在骨發育和骨折愈合過程中高表達。

BMP7屬于TGF-β超家族成員，其前體蛋白包括一個信號肽、一個前結構域和一個羧端結構域，經翻譯后加工形成131個氨基酸殘基的成熟肽，其活性形式為同源二聚體。除了形成同源二聚體，BMP7還會與其它同族BMPs形成異源二聚體，在誘導組織發育中具有重要作用。

研究表明，BMP7是一種多用途的蛋白，除了已經批準的脛骨骨折，BMP7的適應癥可能還包括腎衰的治療、中風后運動功能的恢復、矯形外科重建、口腔蓋髓修復、骨質疏松癥、軟骨修復、帕金森病和Lou Gehrig氏疾病等。

天然BMP7以微量存在于皮質骨內，約為1-2μg/kg，其提取很困難且夾雜有其它物質。產量難以滿足日益增長的科研和應用需要。

中國倉鼠卵巢細胞（Chinese Hamster Ovary，CHO）是目前重組糖蛋白生產的首選體系，具有轉錄后修飾功能、胞外分泌功能、可懸浮馴化和較少的內原蛋白分泌等優勢。但CHO細胞培養成本高，條件難掌握、易污染、表達水平較低。培養基中的血清成分是造成生產高成本的主要因素，血清價格昂貴、批間質量不一致、含動物源成分，大大增加下游純化工藝的復雜性和成本。

發明內容

本發明的目的是提供一株整合了經改造的鼠bmp7基因的CHO細胞株，為一種高效表達重組人BMP7的CHO細胞株，通過大規模培養該細胞株，可以表達和生產具有生物學活性的重組人BMP7蛋白。

本發明所述的一種穩定高效表達重組人BMP7的CHO細胞株，其特征在于能高效表達重組人BMP7蛋白，其核苷酸序列如：SEQ ID NO.1所示。

所述的穩定高效表達重組人BMP7的CHO細胞株的構建方法，包括以下幾個步驟：

1）RT-PCR法提取鼠bmp7基因，通過定點突變得到如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，插入到pCHO1.0載體的多克隆位點，得到重組質粒；

2）將質粒轉入懸浮CHO細胞中；

3）在CD-Forti+Puromycin+MTX篩選培養基中進行加壓篩選，得到混合克隆細胞；

4）挑選單克隆細胞株，篩選得到高效表達重組人BMP7蛋白的CHO細胞株。

所述的穩定高效表達重組人BMP7的CHO細胞株的構建方法，其特征在于所述步驟1）包括以下幾個步驟：