[發(fā)明專利]一種同步檢測(cè)PCV2和PRV感染的引物序列及方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710614696.0
• 申請(qǐng)日: 2017-07-26
• 公開（公告）號(hào): CN107227380A
• 公開（公告）日: 2017-10-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃華榮;羊雪芹;李婧雅;王德全;袁秀芳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙)11465
• 代理人: 王鵬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于同步檢測(cè)PCV2和PRV混合感染的引物序列及方法。

背景技術(shù)

豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)和豬偽狂犬病毒(porcinep seudorabies virus，PRV)感染是當(dāng)前我國(guó)養(yǎng)豬生產(chǎn)中普遍存在且危害嚴(yán)重的DNA病毒病。其中，PCV2爆發(fā)時(shí)死亡率可達(dá)50％以上，因此其已成為當(dāng)前我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)中最重要的傳染病。PRV屬于皰疹病毒科α皰疹病毒亞科，其感染會(huì)引起成年妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊、新生仔豬急性死亡以及三周齡以內(nèi)的仔豬表現(xiàn)神經(jīng)癥狀和高死亡率；據(jù)調(diào)查目前我國(guó)規(guī)模豬場(chǎng)偽狂犬病的血清陽(yáng)性率達(dá)70％以上，危害嚴(yán)重。以上2種病原在臨床上較為常見，并且常常混合感染，其引發(fā)的疾病已經(jīng)給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。

傳統(tǒng)的PCV2感染和PRV感染的檢測(cè)方法有病毒分離、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物接種和血清學(xué)試驗(yàn)等方法，這些方法操作繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)、有的存在非特異性反應(yīng)和敏感度低等缺點(diǎn)，已經(jīng)不能滿足養(yǎng)殖業(yè)的防病需求。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR檢測(cè)方法可以快速、高效地對(duì)病原體進(jìn)行檢測(cè)。

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法，由高溫變性、低溫退火(復(fù)性)及適溫延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)周期，循環(huán)進(jìn)行，使目的DNA得以迅速擴(kuò)增，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)周期短等特點(diǎn)，不僅可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎(chǔ)研究，還可用于疾病的診斷。

常規(guī)PCR操作簡(jiǎn)單，技術(shù)要求低，但對(duì)于多種病毒混合感染需要進(jìn)行多次PCR檢測(cè)，進(jìn)而延長(zhǎng)了檢測(cè)周期，增加了檢測(cè)成本。復(fù)合PCR是指在同一PCR反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)對(duì)多個(gè)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增的方法；利用該方法同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目的基因省時(shí)省力省成本，但反應(yīng)體系中存在的引物很容易形成復(fù)雜的引物二聚體，進(jìn)而影響檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，因此復(fù)合PCR的成功關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)引物的特異性、反應(yīng)體系和程序的優(yōu)化。

現(xiàn)有技術(shù)中有通過多重RT-PCR對(duì)豬的多種病毒進(jìn)行檢測(cè)的方法，但其對(duì)RNA濃度、質(zhì)量要求較高，檢測(cè)過程中極易受到基因組DNA和RNA酶的污染，因此，其對(duì)操作人員技術(shù)要求較高，不利于廣泛推廣應(yīng)用。此外，也存在多重?zé)晒釶CR的檢測(cè)方法，但其探針?biāo)鶚?biāo)記不同發(fā)光波長(zhǎng)的熒光基團(tuán)之間很容易互相干擾，進(jìn)而影響特異性檢測(cè)。

由此可見，對(duì)于PCV2和PRV感染進(jìn)行同步檢測(cè)的方法仍存在很大的發(fā)展空間，本領(lǐng)域技術(shù)人員亟待設(shè)計(jì)一種操作簡(jiǎn)便、技術(shù)要求低、特異性高、穩(wěn)定性強(qiáng)、重復(fù)性好的PCV2、PRV同步檢測(cè)方法。

發(fā)明內(nèi)容

基于現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，本發(fā)明提供一種能夠同時(shí)檢測(cè)PCV2和PRV混合感染的方法。

本發(fā)明為了實(shí)現(xiàn)上述目的所采取的技術(shù)方案是：

一種同步檢測(cè)PCV2和PRV感染的引物序列，其特征在于：包括PCV2病毒引物序列和PRV病毒引物序列；其中，所述PCV2病毒引物序列包括上游引物PCV2-F1和下游引物PCV2-F2；所述PRV病毒引物序列包括上游引物PRV-F3和下游引物PRV-F4；所述PCV2-F1、PCV2-F2、PRV-F3和PRV-F4的核苷酸序列分別如序列表SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

一種同步檢測(cè)PCV2和PRV感染的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)根據(jù)GenBank中登錄的PCV2ORF2基因和PRV gH基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)如權(quán)利要求1所示的兩對(duì)特異性引物；

(2)使用所述兩對(duì)特異性引物對(duì)待測(cè)樣本進(jìn)行復(fù)合PCR擴(kuò)增，得到PCR產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)；若出現(xiàn)470bp大小的條帶，則待測(cè)樣品中含有PCV2病毒；若出現(xiàn)298bp大小的條帶，則待測(cè)樣品中含有PRV病毒。

進(jìn)一步地，所述復(fù)合PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為50.0μL，其中：10×Buffer 5.0μL、2.0mM MgCl₂4.0μL、200μM dNTPs 5.0μL、0.1μM PCV2-F11.0μL、0.1μM PCV2-F21.0μL、0.2μM PRV-F32.0μL、0.2μM PRV-F42.0μL、rTaq DNA polymerase 0.5μL、DNA模板2.0μL、ddH₂O 27.5μL。

進(jìn)一步地，所述復(fù)合PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?5℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃45s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。