[發(fā)明專利]一種用于ESR1突變檢測的檢測試劑盒

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710603551.0
• 申請日: 2017-07-23
• 公開（公告）號: CN107267634A
• 公開（公告）日: 2017-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張道允;鞏子英
• 申請（專利權(quán)）人: 嘉興允英醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于ESR1突變檢測的引物、探針及檢測試劑盒。

背景技術(shù)

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，自20世紀(jì)90年代起，中國乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢。2008年全球乳腺癌新發(fā)病例達(dá)138萬，占全部女性惡性腫瘤的23%，約有45.8萬患者死于該病，其中中國新診斷169452例浸潤性乳腺癌，并且有44908例乳腺癌相關(guān)死亡；21.4%的患者在診斷時(shí)為晚期，67.8%的患者在診斷時(shí)為雌激素受體（ER）和/或孕激素受體陽性。對于激素受體陽性的乳腺癌，內(nèi)分泌治療是其重要治療手段，不論其年齡，淋巴結(jié)狀態(tài)或是是否應(yīng)用化療，都應(yīng)考慮接受內(nèi)分泌治療。對于ER陽性晚期乳腺癌，芳香酶抑制劑（AI）是解救內(nèi)分泌治療的首選藥物。激素受體陽性乳腺癌的內(nèi)分泌治療逐漸進(jìn)入了精準(zhǔn)治療時(shí)代。而內(nèi)分泌的精準(zhǔn)治療以ER信號通路為核心，通過抑制ER信號通路、旁路激活途徑、ER共激活蛋白以及相關(guān)下游效應(yīng)分子等多種方式，抑制激素受體陽性的腫瘤細(xì)胞增殖，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)分泌耐藥，增強(qiáng)內(nèi)分泌治療的療效。

ER是由ESR1基因編碼的一種核蛋白，ESR1屬于核受體家族成員，在乳腺癌發(fā)生發(fā)展的過程中起著非常重要的作用。近期研究顯示，在接受過AI治療的激素受體陽性轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，對雌激素誘導(dǎo)基因的主要調(diào)節(jié)受體——ERα進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，約20%-50%患者的ESR1（編碼ERα的基因）存在突變，這種突變主要簇集在ER的配體結(jié)合域，引起非配體依賴的ER激活，并最終導(dǎo)致內(nèi)分泌治療耐藥以及增強(qiáng)腫瘤轉(zhuǎn)移能力。這種突變有可能是導(dǎo)致相當(dāng)一部分轉(zhuǎn)移性乳腺癌發(fā)生獲得性內(nèi)分泌治療耐藥的原因。研究顯示，ESR1突變主要發(fā)生在LBD區(qū)，使得ESR1發(fā)生自體激活。c.1387T>C（S463P），c.1601T>A（V534E），c.1607-1608TC>AG（L536Q），c.1609T>A（Y537N），c.1610A>C（Y537S),c.1610A>G（Y537C)，c.1613A>G(D538G)是主要的突變位點(diǎn)，約占突變比率的95%。這提示對于此類突變患者再換用其它AI治療效果不理想，但直接靶向于ER的雌激素受體拮抗劑藥物通過與雌激素受體競爭性結(jié)合而抑制其功能，如高劑量的氟維司群。China Confirm亞組分析結(jié)果提示，輔助AI治療失敗后，氟維司群500 mg組的中位PFS為5.8個(gè)月，且基礎(chǔ)研究顯示氟維司群可抑制ESR1突變。從而提示，對于AI治療失敗的患者，氟維司群可能是一種更好的選擇。因此檢測ESR1基因的突變狀態(tài)是篩選AI治療疾病進(jìn)展后接受雌激素受體拮抗劑治療有效的患者的重要前提。

目前已報(bào)道的應(yīng)用于檢測ESR1突變的方法為直接測序技術(shù)和二代測序技術(shù)。其中直接測序技術(shù)成本低，準(zhǔn)確性高，然而需要PCR后處理步驟，既操作復(fù)雜，又容易發(fā)生污染，產(chǎn)生假性結(jié)果；且該方法靈敏度不足，不能完全適應(yīng)臨床樣本的復(fù)雜情況。二代測序技術(shù)靈敏度高，但其依賴于昂貴的儀器和分析軟件，檢測成本大大增加，難以作為普適技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的：提供一種用于ESR1突變檢測的引物、探針及檢測試劑盒，采用了特異的MGB Blocker探針，ESR1特異探針和引物，可以檢測腫瘤組織DNA中ESR1的突變；利用ESR1特異探針和引物具有很高的位點(diǎn)特異性，同時(shí)MGB Blocker阻滯了ESR1非特異性的擴(kuò)增，提高了其靈敏度和準(zhǔn)確性；操作可以在循環(huán)腫瘤DNA中檢測ESR1的突變；操作簡單，檢測廉價(jià)，可以大規(guī)模推廣；檢測速度快，檢測過程大約需要2小時(shí)就可完成。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種用于ESR1突變檢測的檢測試劑盒，所述檢測試劑盒包括ESR1的特異引物、FAM-MGB Taqman探針以及Blocker封閉的MGB探針，

所述的ESR1的特異引物包括如下序列號：

463F: ATTCAGGAGTGTACACATTTCTGC

463R: ATCTTGTCCAGGACTCGGTG

534A:ATGAAGTGCAAGAACGTGGA(55.2)

534R:GCTAGTGGGCGCATGTAGG(59)

536A:AAGAACGTGGTGCCCCAG(58.6)

534R:GCTAGTGGGCGCATGTAGG(59)

1609A:AGAACGTGGTGCCCCTCA(58.9)

534R:GCTAGTGGGCGCATGTAGG(59)